肾细胞癌肿瘤抑制基因VHL的变异多药耐药基因Mdr的表达

1、肾细胞癌肿瘤抑制基因VHL的变异多药耐药基因Mdr的表达摘要：目的探讨人肾细胞癌中的VHL肿瘤抑制基因的变异和Mdr基因的表达水平，同肾癌发生发展的关系。方法采用多聚酶链式反应(PCR)，DNA单链多态性分析和DNA测序的方法分析了40例肾细胞癌标本(其中包括30例富糖原型，6例是嗜染型、3例多形性、1例颗粒型)。用免疫组织化学法检测了正常肾组织和35例肾细胞癌组织切片。结果19/30(63%)的富糖原型肾细胞癌的VHL肿瘤抑制基因发生了变异，其中包括13例缺失、3例插入、2例错译和1例无义。而在对照组未发现基因变异。而Mdr表达与组织学类型相关，且表达量与肿瘤分级有关。结论富糖原型肾细胞癌可

2、能在分子遗传学水平上与其它类型的肾细胞癌有所区别。关键词：VHL肿瘤抑制基因；Mdr基因；肾细胞癌中分类号：R737.11；R730.43 文献标识码：A 文章编号：1000-8578(2000)05-0337-03 The Frequent Somatic Mutations of Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene(VHL) and the Expression of Multiple Drug Resistence(Mdr) Gene in Human Renal CarcinomasJIA Shao-chang(Nanjing 81 Hosp

3、ital,Nanjing 210002，China)YIN Guang-fu(Nanjing 81 Hospital,Nanjing 210002，China)XU Zheng-chang,et al(Nanjing 81 Hospital,Nanjing 210002，China)Abstract:Objective To study the frequent somatic mutations of von Hippel-Lindau tumor suppressor gene(VHL)and the expression of multiple drug resistence(mdr)g

4、ene in human renal carcinomas.Methods:40 cases human renal carcinomas were analyzed for VHL gene using polymerase chain reaction (PCR) and single strand conformational polymorphism analysis.35 cases renal cell carcinomas were examied the product of mdr gene by immunohistochemical assay.Results Somat

5、ic mutations were detected in 63 percent(19/30) glycogen-rich renal carcinomas including 13 deletion,3 insertion,2 missense and 1 nonsense mutation.The degree of mdr gene expression correlated with histopathlogic subtypes of renal carcinomas.Conclusion Glycogen-rich renal carcinomas might be disting

6、ushed from other types by molecular genetic techniques.Key words: Von Hippel-Lindau gene(VHL)；Mdr gene;Glycogen-rich renal carcinomas肾细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一。研究表明，在人肾细胞癌的发生中出现原癌基因激活或抑癌基因失活1。VHL肿瘤抑制基因在一些人肾细胞癌细胞系中出现变异，可能在人肾细胞癌的发生中起重要作用2。Mdr的表达产物p170糖蛋白，可能是导致肿瘤化疗中药物耐受性的因素之一。研究表明，高分化肾癌的Mdr表达量较高，且Mdr表达水平与肾癌的化疗耐受性

7、相关3。我们分析了人肾细胞癌中的VHL肿瘤抑制基因的变异和Mdr基因的表达水平，结果如下。1材料与方法1.1VHL基因的检测40例肾细胞癌组织标本来自本院住院病人，冻存于液氮中，按WHO组织学分类原则分类，其中包括30例富糠原癌，10例非糖原癌(6例嗜染型，3例多形性，1例颗粒型)。按标准程序提取肿瘤组织DNA。根据基因库中VHL基因序列设计6对PCR引物，经产生200-300碱基的PCR产物而又能覆盖所有的VHL阅读框。6对引物如下：5端引物5AAF TAC AGT AAC GAG TTG GCC TAG 33端引物5GTC GAC CTC CGT AGT CGT CG35端引物5CCT A

8、GC CTC GCC TCC GTT ACA AC33端引物5GTA CTC TTC GAC GCC TGC CTA CC35端引物5TGG TCT GGA TCG CGG AGG GAA T33端引物5CCC AGC TGG GTC GGG CCT AAG CGOOGG GOO OGT35端引物5CTG CCC GTA TGG CTC AAC TTC GA33端引物5TGC TAT CGT CCC TGC TGG GT35端引物5GTG GCT CTT TAA CAA CCT TGG C33端引物5CCT GTA CTT ACC ACA ACA ACC TTA TC35端引物5TTC CTT

9、 GTA CTG ACA CCC TAG T33端引物5AGC TGA GAT GAA ACA GGG TAA GT3引物由中科院上海细胞所合成、纯化。PCR反应体系为：100ng组织DNA，1PCR Baffer，15pmol 5端和3端PCR引物，20um dGTP，dATP dTTP和DCTP，0.15ula-35sdATP(1000Ci/mmol)，0.5unit Taq多聚酶。PCR反应过程为：95C1min，62C1min，72C3min，共40个循环。20ml的PCR产物加入20%的梯度聚丙烯酰胺TBE胶电泳，电压为300V，而后干胶，经X线显影，观察SSCP中的异常条带。将SS

10、CP中出现异常条带的PCR产物用双脱氧末端终止法进行直接DNA测序。1.2mdr基因的检测35例肾癌来自19841997年间本院住院患者。组织学分型参见有关资料4。包括透明细胞型(即富糖原型)27例，退行型2例，管状(颗粒状)型5例，嗜酸性细胞型1例。肿瘤分级标准为：1级：细胞小(10um)，核一致，核仁未见。2级：细胞较大(15um)，细胞形状不规则，在高倍镜(400)下可见核仁。3级：细胞更大(20um)，细胞形状很不规则，在低倍镜(100)下可见核仁。4级：除3级的特征外，核多形性，常有染色体固缩。所有的标本冻存于-80C。在冰冻切片上，用抗p170抗体进行免疫碱性磷酸酶法染色，对各组织

11、切片的染色程度进行评分并进行统计学处理。2结果SSCP分析，30例富糠原癌标本中有19例呈现异常的电泳条带。经过DNA测序，发现19例基因变异中，包括13例单碱基缺失和3例单碱基插入造成的移框突变、2例错译和1例无义突变。30例富糖原癌中有19例出现VHL基因变异，而在其它组织学型别中未发现有VHL基因变异。如表1。表1肾细胞癌组织学型别与VHL基因变异组织学原型例数VHL基因变异阳性率(%)+-富糖原型30191163嗜染型6060多形性3030颗粒性1010肾癌各组织类型间的Mdr表达有显著差异(P0.01)，如表2。在透明细胞型(富糠原型)的各亚型之间也存在显著差异。然而，在患者病程分期

12、与Mdr表达之间却没有关联。同样，Mdr的表达似与预后、疾病复发或缓解无关联。 表235例肾癌的Mdr表达组织学原型例数Mdr基因表达计分均数透明细胞型270.9退行型20.05管状型52.0大嗜酸性粒细胞肿瘤性10.01级52.02级160.83级60.151.090.4180.130.23讨论 在癌症发生过程中，有多种基因变异参与其中。在肾细胞癌的发生中染色体3P上的整个区域的基因起着重要作用，其中包括VHL基因5。我们的结果表明约63%的富糖原型肾细胞癌中发生了VHL基因变异，而其它型别未发现变异。这提示富糠原型肾细胞癌的发生背景可能与其它型别有所不同，但由于我们所用的标本数不大，故尚需

13、进一步证实。由于PCR-SSCP分析检测基因变异有一定的局限性6，因而实际上VHL基因的突变率可能要高于这个结果。肿瘤化疗中的药物耐受是较为常见的问题。研究表明，Mdr的表达与此密切相关。肾组织的近端管内表面在正常情况下高表达Mdr mRNA，肾细胞癌也有56%100%。高表达Mdr糖蛋白，且表达高低与组织分化程度正相关，但与病程和转移无关3。在我们的研究中，Mdr表达与肾细胞癌的组织学分型有关。管状型肾细胞癌的p170表达最高。透明细胞型的不同级别间p170表达有显著差异，但平均表达计分为0.9。在退行型或嗜酸性细胞型中几乎无Mdr表达。这种组织学型别之间的差异，可能提示各组织型别癌细胞处于

14、不同的分化阶段，也可能提示各自来源于肾小管的不同细胞。因而对化疗可能有不同的反应。在以前的研究中，关于胃癌和结肠癌中p170糖蛋白的表达，也发现了Mdr表达高低与癌组织分级高低相关7，与我们的结果相似。虽然在我们的资料中，未发现Mdr表达与预后的关系，但在体外试验中Mdr表达是Rcc药物耐受性的信号之一。因而对临床治疗有指导意义。作者单位：贾绍昌（210002南京解放军八一医院）殷广福（210002南京解放军八一医院）苏长青（210002南京解放军八一医院）邓安梅（上海长征医院）陈孙孝（上海长征医院）参考文献：1Shimizu M,Yokota J,Mori N,et al.Introduct

15、ion of nirmal chromosome 3P modulates the tumorigericity of a human renal cell carinoma cell line YCRJ.Cncogene,1990,5:185-194.2Latif F,Tory K,Gnarra J,et al.Identification of the von Hippel-Lindan disease tumor suppressor geneJ.Science(Washington DC)，1993，260：1317-1320.3Chan HSL,Thorner PS.Haddad G

16、,et al.Immunohistochemical detection of p-glycoprotein prognostic correlation in soft tissne sarcoma of childhoodJ.J Chin Oncol,1990,8:689-704.4Christoph F,Rochlitz M,Hartmat L,et al.Multidrug resistance gene expression in human renal cell cancerJ. Cancer,1992，69:2993-2998.5Yamakawa K,Morrta R,Takahashhi E,et al.Adetailed deletion mapping of the short arm of Chromosome 3 in sporadic renal cell carciomaJ. Cancer Res,1991,51:4707-4711.6Taro S,Keiichi K,Soichiro T,et al.Frequent Somatic Mutations and Loss of Heterozygosity of the von Hippel-Lindau T w