鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

1、鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定摘要：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid ，简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用。采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）丙酮溶液处理，除去沉淀物，经丙酮分级沉淀活的粗品，再经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品，然后用Folin-酚法测定卵类粘蛋白的抑制活力测得纯蛋白的抑制活力大于粗蛋白的抑制活力，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳测定蛋白质分子量测得粗蛋白的相对分子量为34311纯蛋白的相对分子量为32924与理论值有一定差距。关键词：鸡卵类粘蛋白; 胰蛋白酶; 有机

2、溶剂 ;层析; 电泳中图分类号：Q 文献标识码：AIsolation and purification of CHOM and its activity 、 molecular weight determinationAbstract: Chicken ovomucoid (CHOM) is a glycoprotein made from chicken egg white, it has a strong role in inhibiting trypsin. Organic solvent precipitation method using egg white by trichloro

3、acetic acid (TCA) - acetone solution was to remove sediment by acetone precipitation of live crude, through the DEAE cellulose (diethylaminoethyl cellulose) column layer Analysis of purified products derived from qualified, then Folin-phenol method ovomucoid inhibited activity, and finally by SDS-po

4、lyacrylamide gel electrophoresis determination of protein molecular weight of coke.Key words: CHOM ;Trypsin ; organic solvent ; chromatogram ; electrophoresis.鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid 简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热度和高浓度的脲都是相当稳定

5、的，在有机溶剂都有较高耐受性（在50% 丙酮或10% 三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度），而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白的等电点有一定的范围，大致在pH 3.94.5。分子量28000Da。采用有机溶剂沉淀法分级沉淀活的粗品。鸡卵类粘蛋白具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算卵类粘蛋白的活力。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可以重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。 11 材料与方法11 材料：1

6、11 试剂丙酮，0.5 M三氯乙酸，0.02 M,pH 6.5磷酸缓冲液，DEAE-纤维素， DE-52，0.5 M氯化钠-0.5 M氢氧化钠溶液，0.5 M盐酸，0.30 M氯化钠-0.02 M，pH 6.5磷酸盐缓冲液，硫酸铵，pH 8.0 Tris-HCL缓冲液（每毫升Tris-HcL缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙），0.4M三氯乙酸 ， 2%酪蛋白 ， 0.4M 碳酸钠 ， Folin乙试剂， 氢氧化钠，30%胶母液 ， PH8.9Tris-Hcl缓冲液 ， PH6.7s-Hcl缓冲液 ，无离子水 ， 10%APS ， 染色剂 ，脱色剂等。112 器材恒温水浴锅、新鲜

7、鸡蛋、温度计、漏斗、透析袋、层析柱（2.8*38 cm）、紫外分光光底计、部分收集器、紫外检测仪（包括记录装置）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、秒表、移液管、高速离心机、垂直板电泳槽、凝胶模样品梳、微量进样器等12 方法：1.21 粗品的制备：取1个鸡蛋得蛋清体积约29mL，盛于250mL烧杯内，放置于温水浴锅内使温度达到25-30，在不断搅拌下加入等体积的4预冷的 三氯乙酸-丙酮溶液（体积比1：2），形成白色沉淀，调节pH至3.0，搅拌约30min，然后离心（4000r/min ）20min 。收集上清液。转入三角瓶里，置冰箱放置1周。缓慢加入大于等于2倍体积冷丙酮，直到白色沉淀产生，置冰箱中放置

8、， 离心（4000r/min） 20min，弃清液，沉淀物加入2mL离子水，溶解沉淀，装入透析袋中对水透析以除去残留的TCA。一周后离心(4000r/m )20min，弃沉淀，量取溶液体积，加入1/10体积的0.2mpH6.5的磷酸缓冲液，摇匀，测量并记录粗品体积（13ml），供下步上柱纯化使用。1.2.2纯化(1)DEAE-纤维素的处理 新纤维素的处理：取50克DEAE-纤维素32，用少量水溶胀1小时，用0.5M氯化钠溶液-0.5M氢氧化钠溶液搅拌处理30min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M盐酸和0.5M氯化钠溶液搅拌处理30min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M氯化钠溶液-0

9、.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。(2)装柱 层析柱垂直安装在铁架台上,夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/2柱体积的水，取一合适的玻璃漏斗安装在柱上端。将处理好的DEAE-纤维素连同水倒入漏斗，不断搅拌使之自然沉降到1cm左右的高度。打开柱下端的硅胶管，搅拌至沉降到柱高的3/4高度(11.5cm)，将硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，预热30分钟。(3)平衡 用0.02MpH6.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，用三倍柱体积（9mL）的0.02MpH6.5磷酸盐缓冲液平衡，连接核酸蛋白检测仪，记录流出速度（1.0mL/min）。始终保持柱

10、床上至少有2cm高度的缓冲液，注意不能干柱。平衡过程中，调试核酸蛋白检测仪。首先将旋钮调到T100%，调“光量”到显示100，再将旋钮拨到A，调节“调零”到显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节，使A保持为0。(4)上样及洗脱 待柱床上方的缓冲液快流尽时，立即贴壁加1mL样品，使样品缓慢流下，再用二倍柱体积0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液到柱上，保持2cm的高度。继续平衡，观察核酸蛋白检测仪的A值变化。当A值急剧上升时，计时并记录数值，收集流出液。当A值上升到最高值时，计时并记录数值，下降到数值保持稳定时改用0.3M氯化钠-0.02M PH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，同上，计时并记录数值，收集

11、流出液。将收集到的溶液放在透析袋中，先对水透析，再用蔗糖浓缩直1-2mL.1.2.3酶活力测定（1）粘蛋白对胰蛋白酶的抑制1和1：0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL）+0.5mL pH 8.0PB buffer；2和2：0.5mL粘蛋白粗品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），调pH=8.0 40保温20分钟；3和3：0.5mL粘蛋白纯品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），调pH=8.0 40保温20分钟。取6支试管，如上所述，使粗品和纯品在PH8.0条件下，充分与胰蛋白酶结合，抑制其活性。经抑制后，按表1所列顺序加样。（2）胰酶及粘蛋白酶抑制剂后对酪蛋白底物的水解管号

12、1122 1.0 0表1 胰蛋白酶及粘蛋白抑制后水解酪蛋白底物加样3 1.0 2.03 1.0 0样品（mL) 1.0 0.4M三氯乙酸(mL)2.01.0 1.0 40预热5min 02.02%酪蛋白 1.0 0.4M三氯乙酸(mL)1.0 1.0 1.0 40继续水浴10 min 2.02.01.0 01.0 2.0水浴10min 7cm滤纸过滤，得滤液（3）各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应另取6支试管按表2加样。表2 各管酶促反应滤液与Folin-酚试剂反应加样表1滤液（mL） 0.4M碳酸钠（mL） Folin乙试剂（mL）40水浴20min后，测定A680nm注：在测定A68

13、0nm时，以1调0测1； 以2调0测2； 以3调0测3。（4）酶活力单位定义及计算公式酶活力单位U：40下，每min每mL酶液水解干酪素产生1微克酪氨酸所需的酶量。 计算公式：酶活力单位=OD*4/10*n*k OD：1mL酶促反应液测得的OD680 4：酶促反应体积 10：酶促反应时间N：酶液的稀释倍数（本实验中n为1，各管内含胰蛋白酶均为1mL，2mg/mL的胰蛋白酶溶液） K：1个OD值相当于酪蛋白的微克数本实验k为102（给出） 1管测定出的OD 按上面公式计算，得出胰蛋白酶活力；2管测定出的OD 按上面公式计算，得出粗品抑制后的剩余胰蛋白酶活力； 3管测定出的OD 按上面公式计算，得

14、出纯品抑制后剩余胰蛋白酶活力； 1.2.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量（1）配胶 按表3顺序在小烧杯中配制分离胶溶液（分离胶浓度10%）表3 分离胶的配制1 1.0 5.0 1.01 1.0 5.0 1.02 1.0 5.0 1.02 1.0 5.0 1.03 1.0 5.0 1.03 1.0 5.0 1.0总体积30%胶母液pH8.9butter含SDS，TEMED（mL）无离子水（mL） 10%APS（ul）立即混匀，迅速将其灌注在玻璃板的缝隙内（约2/3高）待分离胶完成后（约30分钟），倾出覆盖水层，用滤纸吸净残留水。 按表4加样制备浓缩胶（浓缩胶浓度3.6%）5 mL 1

15、.651.25 2.1 40表4浓缩胶的配制总体积 30%胶母液pH6.7butter含SDS，TEMED（mL） 无离子水（mL） 10%APS（ul）2 mL 0.24 0.5 0.9 30在玻璃板上面1/3灌注浓缩胶。立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，待凝。（2）对样品进行处理 将样品（25ul）、BSA(15ul)分别与样品液1：1混合，和Marker一起在100水浴加热3分钟，使蛋白质充分变性并与SDS结合。 （3）点样按表5顺序点样表5 点样顺序点样孔 样品 点样量1 粗品 102 粗品 63 粗品 456 BSA 207 纯品 38 纯品 69 纯品 1010 纯品 20粗品 M

16、arker 220（4）电泳将电泳槽和电源相连，调节好电源电压100V，待样品进入分离胶后调节电压150V。待电泳完毕后，调节电压为0，关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，撬开玻璃板。取下凝胶，切下右下角做记号。放入平皿中（5）染色将考马斯亮蓝R250染色液加入平皿，没过凝胶，脱色摇床旋转染液10分钟，用滴管将染色液回收到试剂瓶。（6）脱色用水洗去凝胶表面的浮色，弃水，加入脱色液，脱色至凝胶背景的蓝色退去。 测量相对迁移率，绘图2结果与分析2.1鸡卵类粘蛋白粗品的制备及纯化结果首先得29mL蛋清液，透析后得到13mL粗品，取1mL纯化后得到的纯品。测得流速为1.65mL/min 在前四分钟内流出

17、的是粗蛋白那段时间内A值为零，离子交换洗脱表A68粘蛋白纯品洗脱表时间 0:00:00 0:00:30 0:01:00 0:01:30 0:02:00 0:02:30 0:03:00 0:03:30离子交换洗脱如图1A680 5 24 64 65 65 61 44 30时间 0:04:00 0:04:30 0:05:00 0:05:30 0:06:00 0:06:30 0:07:00 0:07:30A680 30 31 33 33 32 30 32 30时间0:08:00 0:08:30 0:09:00 0:09:30 0:10:00 0:10:30 0:11:00 0:11:30 37 39

18、 35 38 36 19 19 1972吸光度A680543618001015体积(mL)202530图1 离子交换洗脱结果分析：在前四分钟A值为0说明没有杂蛋白，在收集纯蛋白时出现小的峰值，原因可能是粘蛋白的组分差距大或是仪器不稳。在A值变化较快的一段时间内记录的A值太少不能准确得出峰值。 2.2 Folin-酚法测定胰蛋白酶的酶活力及卵粘蛋白的抑制活力 由酶活力的计算公式得表6表6 酶活力及卵类粘蛋白的抑制活力A680nm 0 活力及剩 余单位数（U） 粘蛋白抑 制活力通过计算得纯化总表,表7。-3.101-0.8160.059 2.4070.135 5.5080.079 3.223总活力

19、=总体积×每毫升的抑制活力 收率=纯品的总抑制活力÷粗品的总抑制活力表7 纯化总表步骤丙酮-TCA粗提 DEAE-CellLose结果分析：胰蛋白酶的酶活力比加入类粘蛋白后的剩余活力还要小的原因可能是：在实验操作时1在水浴时掉进了水浴锅里，反应时间相对短了；在调节pH值时没有调太准确导致误差。 2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 2.3.1染色结束后，测量蛋白质及示踪染料的迁移距离。计算Rf值：Rf=蛋白质的迁移距离/示踪染料的迁移距离，蛋白质的前一距离为分离胶界面到蛋白质条带的实际位置的距离总体积/mL131.5总活力/U -18.606 -4.896收率

20、 1 26.3%图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1:粗品点样量为10uL； 2:粗品点样量为6uL；3:粗品点样量为4uL； 4:粗品点样量为2uL；5:Marker点样量为20uL（分子量依次为：97400 66200 43000 31000 20100 14400）； 6:BSA点样量为20uL； 7:纯品点样量为3uL； 8:纯品点样量为6uL； 9:纯品点样量为10uL； 10:纯品点样量为20uL；前沿距离5.0cm各蛋白的迁移率以及相对分子质量见表8.表8各蛋白迁移率及相对分子质量BSA粗品纯品Maker 1平均距离（cm） 迁移率 0.360 分子量 68242 分子量对数0.6

21、60 343110.678 329240.216 97400 4.98860.350 662000.560 430000.720 310000.930 201001.00 144001.803.303.391.082 1.753 2.804 3.605 4.656 5.004.834056 4.535436 4.5175194.8209 4.6335 4.4914 4.3032 4.15842.3.2绘制标准蛋白质分子量对数与相对迁移率的标准曲线本试验使用的是已知分子量标准蛋白Marker，由6种标准蛋白组成，以已知蛋白质分子量的对数值为纵坐标，RF为横坐标绘图，可得到一条直线，求出程回归方。结果分析：提取的鸡卵类粘蛋白的相对分子质量与28000相差较大可能是因为所提取的蛋白质不