糖尿病动物模型及其在DR的应用

1、糖尿病动物模型及其在DR的应用        【摘要】     糖尿病动物模型（DM模型）是糖尿病研究的基础。DM模型基础上建立的DR模型为糖尿病性视网膜病变提供很好的病理模型，在糖尿病性视网膜病变研究中起很重要的作用。DM模型主要可分为化学物质诱导性模型、自发性遗传性动物模型、胰腺部分切除模型和转基因模型等4种。其建立方法各有优缺点.实验性糖尿病动物模型价格低廉，可操作性强，并且在一定程度上符合人类糖尿病形成的病理过程，成为目前研究糖尿病的最主要动物模型，特别是S

2、TZ注射模型最为普遍；而基因敲除复制模型随着技术的发展，将有广阔的发展前景。     【关键词】  糖尿病 糖尿病性视网膜病变 DM模型 DR模型    0引言    糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足而导致的以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。目前已成为全球性流行病，我国发病率为5%。糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病常见并发症之一，在我国有逐年上升之势。DM动物模型在研究DR中起很大

3、作用，是研究DR发病机理、临床表现和防治方案的基础。 它主要可分为化学物质诱导性模型、自发性遗传性动物模型、胰腺部分切除模型和转基因等4种类型。但多数模型仅有背景性糖尿病性视网膜病变，增殖性病变较少。目前，国内外对DM的大鼠实验动物模型的建立有多种方法，判断模型是否成功的指标主要是血糖和尿糖。本文按DM分类将常用DR模型的构建方法及在糖尿病性视网膜病变方面的应用综述如下。1模型构建1.1化学药物性模型链脲佐菌素（STZ）注射动物模型是目前DM模型中使用普遍的一种，因其效果显著而稳定在糖尿病性视网膜病变研究中被广泛应用。STZ模型制作方法较简单，1次大剂量ip即可成模。于德明等1将造模大鼠禁食1

4、0h，用 STZ溶于0.1mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)，配成10g/L溶液，按50mg/kg单次ip，5d后取尾静脉血测定血糖，血糖167mmol/L为 DM大鼠(成模率100%)。也可采用ip 100g/L STZ70mg/kg，48h后血糖>13.8mmol/L，且尿糖+持续3d以上者视为糖尿病。STZ制备模型的方法多样，小剂量多次ip，配合福氏完全佐剂(CFA)或高脂饲料喂养等。除腹腔外，尾静脉注射STZ也是可行的方式。四氧嘧啶（ALX）是胰岛细胞毒剂，通过损伤细胞内DNA和mRNA功能，使细胞合成前胰岛素减少，导致胰岛素缺乏，其诱导的糖尿病动物模型在病理生理上人类

5、胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)相似。将ALX临用前配成1050g/L水溶液，在动物空腹1224h后，按120150mg/kg 1次性ip，24h后血糖值升高 (16.7mmol/L)，持续2wk以上可选用。大剂量四氧嘧啶可致大部分细胞破坏，使犬、猫等动物产生永久性糖尿病，但部分啮齿类动物（如鼠）形成的四氧嘧啶糖尿病可发生自发性缓解。如用120mg/kg连续注射2d，成模率可达100%。但应注意四氧嘧啶对动物的肝、肾的毒性作用 。    ALX和STZ制作动物模型，目前已被广泛应用于DR发病机理、防治及微循环形态学改变等研究。将STZ注入雌性Wistar鼠(45m

6、g/kg)体内，造模后8mo，电镜观察发现49%糖尿病鼠视网膜外丛状层毛细血管基底膜增厚，含较多束状胶原纤维、空泡和高密度包含物2。而Hammes等3观察到STZ诱导糖尿病鼠24wk时视网膜毛细血管数量显著增多，而周细胞数较正常鼠减少47%，至56wk上述改变更为明显，且毛细血管基底膜显著增厚，而血管瘤最早在32wk出现。1.2自发性糖尿病动物模型 该模型绝大多数采用有自发性糖尿病倾向的近交系纯种动物。其制备靠动物在自然情况下形成，按照饲养条件喂养 ，自发成模。但因其对动物种属、繁殖和饲养条件要求严格，且数量有限，故实际应用受到限制。1型自发性糖尿病类型常用的有NOD小鼠、BB大鼠和

7、OLETF大鼠等，当在DR研究方面以南非多乳头鼠比较典型。它于1969年在密苏里医学中心首次被确诊为自发性糖尿病，其病理改变见于胰、眼、毛细血管、肾和肝，但视网膜病变的专门性研究尚不充分。该模型与人糖尿病间相似处很多，包括征群的变异，继发性损害的出现(微血管瘤病变、白内障等)以及遗传作用等4。而2型糖尿病动物模型则以db/db 小鼠为代表，其发病过程与人 T2DII非常相似，是国际上广为采用的研究 T2DII和 DR的动物模型。李强等5对1975年Goto等培育的GK大鼠其进行DR模型评估，发现其视网膜毛细血管腔闭塞，基底膜呈阶段性明显增厚膨隆，但未见明显PDR改变；这同人的DR背景期及其相似

8、，从而确认GK大鼠可作为DR模型。2型模型还有中国仓鼠和近交系 KK小鼠，后者有明显的糖尿病肾病和视网膜病变，对糖网病的研究有很大作用。    STD大鼠是新的糖尿病性视网膜病变模型，它是SD大鼠的亚型，能自发产生糖尿病。眼部并发症有白内障、DR和新生血管性青光眼。约40周龄时发生白内障，55wk发生DR，血管异常核糖尿病性牵拉性视网膜脱离常见，但较少出现视网膜出血。FFA显示因视网膜新生血管而出现的高荧光渗漏。多数病鼠视网膜铺片可见非细胞样毛细血管、周细胞丢失和视网膜血管广泛缩窄。电镜检查发现视网膜基底膜增厚。在STD鼠的晚年时期可见虹膜新生血管纤维膜发生及眼前

9、房出血6。1.3胰腺部分切除模型 大多数动物(狗、猫、大鼠、兔、犬、猴等)在行胰腺大部切除(80%90%)后，残存的胰岛受到高糖饮食刺激后使胰岛细胞功能衰竭形成永久性糖尿病；或结扎动物胰管加高糖饮食使胰岛形成明显的退变而形成糖尿病。在糖尿病性视网膜病变应用方面，有学者 7报道采用猫行胰腺切除法造模建立DR动物模型，经长期观察，发现其眼底逐渐出现微血管瘤、点状视网膜内出血及毛细血管无灌注区等视网膜内微血管异常；该模型优点为猫不易产生白内障，能较好地观察眼底变化。1.4转基因动物模型 目前转基因动物的研究越来越多，技术将逐渐成熟，在糖尿病研究中将有很大应用。利用转基因、基因敲除

10、、诱发突变等手段，可以用来寻找糖尿病相关基因，研究糖尿病相关机理，胰腺胰岛进化发育以及各种基因的表达、激素的分泌8,9，但在DR应用方面未见报道。现在使用的转基因模型有GK/IRS1双基因剔除小鼠、IR+/IRS+/双基因剔除杂合体小鼠、IRS2/小鼠等。基因芯片等各种新技术的出现及应用，对糖尿病动物模型的研究必将更深入、更全面、更科学。1.5特殊膳食诱导 给实验动物过量的食物或高蛋白、高脂、高糖饮食，均可使动物细胞负荷过重而发生萎缩，从而引起糖尿病，建立胰岛素抵抗的动物模型。半乳糖血症狗是第1个反映类似人类DR在临床及组织学上所能观察到的所有视网膜改变的动物模型。采用长期喂养高半乳

11、糖食物的方法建立DR动物模型，用含300g/L半乳糖的食物长期喂养狗，经35a后，这些狗明显地产生了类似人类DR的早期损害，包括影子周细胞、影毛细血管、微动脉瘤、毛细血管阻塞、无灌注以及视网膜出血。其血液呈半乳糖血症，血中已醛糖含量增多，糖基化血红蛋白亦超出正常，但血糖、脂肪酸、游离氨基酸并没有增高，血中胰岛素亦正常；后期，这些狗产生了增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)样改变，如视网膜或视乳头新生血管，视网膜前纤维膜等10,11。此外，给C57BL/6小鼠及BALB/L小鼠喂含300g/L及500g/L半乳糖的饮食，经2126mo，在喂饲含300g/L半乳糖食物小鼠中可见明显早期DR样损害，但

12、其死亡率较高。该模型适合于应用分子生物学技术进行DR病因病机研究，是一种并不昂贵的模型。1.6其他 病毒(如鼠脑炎病毒M型变异、柯萨奇病毒)、激素（糖皮质激素、胰高血糖素和生长激素）和免疫等也均可构建DM模型，但在DR模型方面研究尚不充分。综上所述，糖尿病性视网膜病变动物模型是在糖尿病模型基础上发展而来的。多数的动物模型仅表现为背景性糖尿病性视网膜病变，增殖性视网膜病变少见。大部分实验动物(猴、猫、狗、猪、鼠等)有精细复杂的血管网，可用于DR实验研究，但兔视网膜仅部分区域有血管，且血管限于视网膜表面，不宜用于进行DR研究。2 DR模型与DR研究    利

13、用DR模型实验，可以从DR发病机制临床表现和防治方案等角度进行研究。2.1代谢与DR 慢性高血糖是糖尿病性视网膜病变发生的重要因素；高血糖状态下，视网膜组织先发生代谢变化，其次为结构变化。血糖控制与视网膜损害进程密切相关，控制好，则损害停止；控制不好则损害呈进行性。研究表明高血糖可使视网膜糖酵解过程中三个关键限速酶活性下降。目前高血糖对视网膜损害的机制尚不清楚，有以下几种学说。肌醇假说  Mandario在实验动物中观察到视网膜山梨醇上升同时伴有肌醇含量下降，从而提出该假说。在高血糖状态下，醛糖还原酶活性增强，山梨醇通道活跃，山梨醇在细胞内聚积，引起渗透压增高，导致细胞损伤

14、，使毛细血管张力降低，进而形成微血管瘤。胡玉章等12观察到ALX糖尿病大鼠即使在部分血糖降至正常时其视网膜内过量山梨醇、果糖仍滞留而不排出，认为临床及实验中所见DR在血糖控制后仍继续发展可能与此有关。现已证明糖尿病实验动物晶状体中醛糖还原酶活性和山梨醇浓度均居高，但在神经和血管中增高不明显，不足以引起渗透压变化。高血糖也影响肌醇代谢，通过与肌醇竞争受体而使细胞内肌醇减少。异常的肌醇代谢是造成周细胞衰亡的机理之一。与山梨醇升高相关的还有Na+，K+ATP酶活性的降低。对兔的实验性糖尿病研究发现，色素上皮细胞内山梨醇浓度增加，肌醇含量下降，Na+，K+ATP酶活性降低。糖尿病视网膜毛细血管病变的发

15、生是否如此学说所述目前仍不清楚。甘油二酯学说  高血糖通过提高组织内DAG含量而使 PKC 活性增强，但机理仍不清楚。Aeillo等13血糖增高可减弱周细胞和血管平滑肌中Caldsman的表达，而PKC抑制剂能在mRNA水平阻止后者表达的减弱，表明PKC活性增强在基因水平诱导高血糖反映，从而进一步说明PKC活性增强可以影响微血管细胞中包括生化代谢和基因调节在内的多个通路。葡萄糖及其他糖类对大分子物质具有非酶糖化而形成共价产物即糖基化终末产物（AGE）的功能。后者可能通过直接改变蛋白质的功能、信号传递途径及特异性受体改变细胞基因表达而引起病理改变。糖尿病大鼠视网膜的无细胞毛细血管数目比

16、正常增加19倍，但在动物模型中采用氨基胍嘧啶（特异性AGE抑制剂）治疗后，通过防止AGE过量积累，使无细胞毛细血管数目减少80%，并使糖尿病诱导的周细胞消失显著减少。2.2血流和血液与DR 血液流变学异常被认为在糖尿病性视网膜病变早期有某些作用。研究表明明显的糖尿病性视网膜病变发生之前已有血流速度的异常改变，而此时血管直径尚未发生变化。糖尿病鼠视网膜上有多处白细胞增多、循环血中白/单核细胞密度明显高于对照组；糖尿病猴视网膜也发现中性粒细胞聚集异常增多，白细胞对血管内皮粘附增强。具有活性的白细胞可能产生毒性产物破坏视网膜和血管。这说明白细胞和内皮细胞是产生栓塞的关键因素，从而导致血流速

17、减慢微血管瘤和新生血管发生。2.3血管生长因子与DR 在众多发现的血管生长因子中，血管内皮生长因子（VEGF）成为目前糖尿病性视网膜病变机制研究的焦点14,15。它是血管系统形成的必需成分，组织缺氧可增加其表达。研究发现有糖尿病倾向大鼠在确诊之前，已经出现视网膜VEGF表达轻度增加，发作后VEGF、VEGF受体和VEGF mRNA都明显增加。视网膜神经节细胞层及内、外核层VEGF及其受体nk1及nt1表达也显著增高16.此外，在糖尿病鼠视网膜上发现IGF和Akt磷酸化水平轻度升高，可能与视网膜增殖性病变有关17。2.4神经疾病和DR 目前发现在糖尿病早期视网膜神经元已有死亡，较之细胞活化及神经元蜕变可能是糖尿病性视网膜病变的重要环节。糖尿病性视网膜病变时，胶质细胞活化，GFAP和内皮细胞上的转膜蛋白表达下降，导致较之细胞维护血视网膜屏障功能下降。糖尿病鼠相比于正常鼠，视网膜神经元凋亡增加，视网膜厚度减少，胰岛素治疗可缓解。病鼠视网膜的Müller细胞和光感受器L谷氨酸盐和氨基丁酸（GABA）表达增加18糖尿病早期，视网膜GABA及氨基己酸增高，压抑并破坏视网膜内