绿色荧光蛋白高表达动物模型的建立及在活体成像中的应用

1、绿色荧光蛋白高表达动物模型的建立及在活体成像中的应用*        【摘要】     目的 建立绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因标记的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，利用自行研制的荧光分子成像仪实时地观察肿瘤的生长、转移、肿瘤血管生成及药物疗效的观察。方法 （1）体外扩增稳定表达GFP的LLC肿瘤细胞，荧光倒置显微镜观察绿色荧光表达情况；（2）LLC-GFP细胞以浓

2、度为2×106/ml接种裸鼠背部，以建立LLC裸鼠移植瘤模型；（3）分别在接种瘤细胞2周后，每隔3天对裸鼠进行活体成像1次，观察肿瘤的生长、转移及局部血管生成情况，同时给予环磷酰胺（CTX）10 mg/kg治疗并测定抑瘤率。结果 （1）培养24 h后，用荧光倒置显微镜观察，可见几乎所有LLC-GFP细胞发出明亮的绿色荧光；（2）LLC裸鼠移植瘤模型建立后，用波长470 nm的蓝光激发，通过荧光活体成像仪观察可见肿瘤发出绿色荧光；（3）活体成像可见肿瘤的生长呈进行性动态变化，4周后可见胸腹腔等广泛转移，同时观察到肿瘤的血管生成和发展情况，环磷酰胺组肿瘤大小明显小于阴性对照组（P<

3、0.05）。结论 荧光分子成像的方法可以对肿瘤的生长、转移、血管生成及药物疗效判定等方面进行无创、实时地连续监测，为研究肿瘤提供了新的思路和方法。     【关键词】  绿色荧光蛋白 分子影像 Lewis肺癌          Development of GFP high-expressing animal model and its application to molecular imaging in vivo    L

4、I Qun,SHEN Bao-zhong,DU Jie.Department of Radiology,Tongji Hospital,Tongji University,Shanghai 200065,China    Abstract  Objective  To develop nude mice model of Lewis lung carcinoma （LLC） expressing green fluorescent protein （GFP） and observe the tumor progression,further m

5、etastasis,angiogenesis and the effect of CTX on tumors in a noninvasive,alive,real-time and sequent way with small animal fluorescent imaging system made by ourselves.Methods  （1）LLC cells stably expressing GFP in vitro were cultured and observed with fluorescent inversion microscope.（2）LLC- GF

6、P cells were harvested and injected subcutaneously on the back of the nude mice at 2×106 cells/ml till transplanted tumors developed.（3）Fluorescence imaging system was used to image mice alive two weeks later and every three days to observe the progression,further metastasis,angiogenesis of loc

7、al tumors and tumor-inhibiting effect of CTX （10 mg/kg）.Results  （1）After cultured for 24h,almost all the LLC- GFP cells emitted bright green fluorescence.（2）Two weeks later observed by fluorescent imaging system,LLC transplanted tumors emitted green fluorescence when activated by 470nm blue li

8、ght.（3） In vivo imaging it suggested that tumors gradually grew up in volume,and there was extensive metastasis four weeks later.The angiogenesis and development of transplanted tumor could be seen,and the average size of tumors in CTX treatment group was smaller than that in control group （P<0.0

9、5）.Also,it could be seen that most tumors emitted green fluorescence which increased with tumor growth without fluorescence attenuation.Conclusion  Fluorescent molecular imaging technique can stably and conveniently monitor tumor growth,metastasis,angiogenesis and treatment effect evaluation of

10、 anticancer drugs in vivo in a real-time and noninvasive way,which provides a new idea and method and plays an important role in tumor research.    Key words  green fluorescent protein;molecular imaging；Lewis lung carcinoma    简便、直观地获得肿瘤在活体上早期的细胞和分子生物学水平的信息，并对肿瘤治疗早

11、期疗效进行判断，一直是肿瘤研究的目标之一，也是当今国际肿瘤研究的热点和难点。在分子影像学成为一个学科以前，没有任何的手段能克服这一难题。    分子影像学是将分子生物学与影像学相结合，用细微影像设备对活体动物的生理及病理过程，从细胞和分子水平上进行影像学的描述和测定。这一成像过程主要依靠分子影像探针的介导，使其标记的靶细胞或与之共同表达的目的基因成像。分子成像技术分为光学分子成像、MR分子成像、核素分子成像。其中，光学分子成像具有一定的优势，其技术相对稳定，可应用不同影像探针发出不同波长的荧光来研究不同基因的同时表达，与MR分子成像、核素分子成像相比，所用设备造价

12、不高，因而具有广阔的应用前景。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因是光学分子成像最常用的报告基因，利用它标记Lewis肺癌移植瘤国际尚未见有报道，本研究建立荷GFP基因标记的小鼠Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma,LLC）移植瘤裸鼠模型，应用自行研制的荧光成像仪进行活体成像，以无创、实时和动态地观察研究肿瘤的生长、转移、肿瘤血管生成及治疗效果，以此为国内分子影像学研究做初步的探索。    1  材料与方法    1.1  实验材料  活体荧光

13、成像仪（Macroillumination imaging system and tunable lighting system）为自行研发；OLYMPUS XT70型荧光倒置显微镜，购自日本OLYMPUS公司；BC110型电子天平，购自德国赛多利丝股份有限公司；RPMI-1640培养液，购自Gibco公司，批号20030810；胰酶，购自Sigma公司，批号20031110；胎牛血清，购自中国医学科学院血液学研究所，批号20030609。其他均为国产试剂纯。    1.2  动物模型的建立    1.2.1  细

14、胞培养  小鼠Lewis肺癌（Lewis lung cancer,LLC）和稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的LLC细胞系（LLC-GFP），均由哈尔滨医科大学肿瘤研究所冻存。常规方法使细胞复苏后，将细胞接种于25 cm2细胞培养瓶内，加入RPMI-1640完全培养液（RPMI-1640加入10小牛血清、青霉素100 u/ml、链霉素100 u/ml），置于37 培养箱中培养。细胞为半悬浮生长，待覆盖率为80%左右，消化、传代。传代培养24 h后细胞进入对数生长期，将细胞培养瓶置于荧光倒置显微镜下，用470 nm蓝光照射培养瓶进行激发，于高倍镜下观察细胞的荧光表达情况，待所有细胞均发出

15、明亮的绿色荧光时即可用于接种于裸鼠。    1.2.2  移植瘤模型的建立  24周雄性裸鼠10只，体重1820 g，购自上海实验动物中心。将对数生长期的LLC-GFP细胞消化、收集，用细胞计数板计数，制成2×106/ml的单细胞悬液，按照0.2 ml/只皮下接种于裸鼠背部。取LLC细胞，以同样方法接种于2只雄性裸鼠，作为模型成像的对照。    1.3  活体成像    1.3.1  肿瘤生长动态成像  肿瘤细胞接种于裸鼠后，于第7天、18天、2

16、9天和40天，分别应用自行研发的GFP光学活体成像仪对裸鼠进行活体成像：用50 W汞灯作为光源，光线聚焦后，经470 nm/40带通滤色片，形成亮度可调的高亮度蓝色激发光，经光导纤维传输形成线形光束。将模型鼠置于黑色背景载物台上，高亮度蓝色激发光照射裸鼠全身，聚焦于瘤体上，通过515 nm/20带通的滤色片观察到峰值为508 nm的绿色光。通过CCD数码相机采集图像，经Microfire图像处理软件处理成像，图像分辨率为1600 dpi×1200 dpi。    1.3.2  肿瘤转移的成像  裸鼠移植瘤模型随机选取2只，于第40天最

17、后一次成像后，断髓处死。置于黑色背景载物台上，打开470 nm高亮度蓝色激发光源，透过515 nm/20带通的滤色片观察，剖开胸腹腔，然后用荧光成像仪采集图像，观察肿瘤在裸鼠全身、各脏器和淋巴结的转移情况。    1.3.3  肿瘤血管生成的成像  将对数生长期的LLC-GFP细胞，制成浓度为2×106/ml的单细胞悬液，按照0.2 ml/只皮下接种于血管较少的足背部。待接种后34周，肿瘤生长至1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm时，荧光成像仪观察肿瘤血管生成情况。    1.3.

18、4  活体成像对CTX抑瘤率的评价  将裸鼠随机分为三组，即空白对照组、模型组和环磷酰胺（CTX）组。接种LLC-GFP细胞两周后，每日肿瘤局部注射给药治疗，其中CTX为10   mg/kg，模型组给予相应剂量的生理盐水，空白对照组不予任何处置。给药2周内，每隔3天将各组动物麻醉，用荧光成像仪进行活体成像1次，观察和记录肿瘤生长情况，并评价CTX的抑瘤效果。    2  结果    2.1  培养细胞的荧光表达  对数生长期的LLC-GFP细胞置于荧光倒置显微镜下观

19、察可见约有90%以上的细胞在470 nm蓝光激发下发出绿色荧光（图1）。    2.2  移植瘤模型的建立  细胞接种后2周，裸鼠背部均长出平均大小约为1.2 cm×1.2 cm×1.0 cm的瘤块，可见动物活动度略有减少，食欲不振。用荧光成像系统进行活体成像，激发光波长（470±20）nm，曝光时间343 ms，增益11。可见接种了LLC-GFP细胞的裸鼠背部肿瘤发出明亮的绿色荧光（图2a），且荧光强度不随照射时间的延长而减弱；而接种了LLC细胞的裸鼠活体成像未见有绿色荧光（图2b）。  &#

20、160; 2.3  肿瘤生长动态成像  在肿瘤细胞接种后第7天、18天、29天和40天，分别应用荧光成像仪对裸鼠进行活体成像。可见接种后1周开始小鼠背部均可见绿色荧光团块，随着生长时间的延长，发出绿色荧光的区域（即肿瘤部位）逐渐增大，经测量瘤从0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm逐渐增至2.0 cm×2.1 cm×1.5 cm，且荧光强度无衰减（图3）。至25天时肿瘤表面出现肉眼可见的干酪样坏死（图3c），坏死处不发出荧光，但周围瘤组织仍可见明亮的绿色荧光。    2.4  肿瘤转移的成像&

21、#160; 在肿瘤细胞接种后40天，将模型鼠胸腹腔剖开，分别应用荧光成像仪进行成像，可见肺、胃、肝、膀胱、大网膜及肠系膜淋巴结和左上肢肌肉均有绿色荧光表达（图4）。    2.5  肿瘤血管生成的成像  在肿瘤细胞接种后40天起，应用荧光成像仪对足背部的肿瘤进行成像，可见绿色荧光背景上清晰的血管网分布（图5a），小血管和毛细血管管腔扩张、弯曲（图5b），血管密度随时间增长及肿瘤增大而增加。    2.6  抑瘤率的评价  给药40天后，可见CTX组肿瘤生长缓慢，瘤体积显著小于模型组（图6），其肿

22、瘤生长曲线与正常对照组的趋势相一致（图7）。    图7  肿瘤细胞生长曲线    3  讨论    1999年9月，Weissleder正式提出分子影像学的概念1，2。国际上，以哈佛大学为首的一些著名大学和研究机构都相继成立了分子影像研究中心，日本及欧洲很多国家也都积极投入了这一生命科学新领域的研究。    绿色荧光蛋白（green fluorecsent protein,GFP）基因是目前在光学分子成像中应用较多的一种报告基因3，4。其最明显优势是无需

23、底物或辅因子参与，无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。在激发光下，可自发地发射内部荧光，易于观察，因此适合作为报告基因来研究基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。近年来，GFP开始应用在肿瘤的分子成像研究方面，由于GFP能在活细胞中直观地观察到外源基因的表达，较快筛选基因修饰的细胞，又不需外源物质参与和对细胞无毒性5，因此本研究把GFP作为标记基因。    本实验应用稳定整合GFP基因的小鼠Lewis肺癌细胞（LLC-GFP），建立了GFP高表达的裸鼠LLC移植瘤模型。体外培养LLC-GFP肺癌细胞，当大部

24、分细胞进入对数生长期后，细胞中GFP开始大量表达，荧光倒置显微镜下可见90%以上的细胞均发出绿色荧光。一般来说，建立肿瘤动物模型时，直到肉眼可见的或可触及包块稳定存在两周左右，才说明模型成功建立。但本实验将对数生长期LLC-GFP细胞接种于裸鼠背部皮下，1周后用蓝光激发后即可见接种部位发出绿色荧光。而且，随着时间的延长，肿瘤逐渐长大，几乎全部肿瘤都发出绿色荧光，且荧光强度不衰减。这说明所建立的模型稳定，完全适合用于荧光活体成像，其所见荧光部分基本可代表肿瘤区域。    传统的影像技术由于仪器的分辨率较低等问题，而对肿瘤的早期阶段很难进行明确的诊断6。本实验中，在肿

25、瘤细胞接种后1周，应用荧光活体成像仪即可检测到肿瘤的存在，为临床肿瘤的早期诊断提供了一种极具前景的诊断方法。此外，还应用荧光活体成像仪对肿瘤的动态生长情况进行了监测，无需其他成像手段或仪器的辅助，在活体上实时、连续、无创地观察肿瘤的生长，这种分子影像学技术的应用在国内尚属首例，为临床上肿瘤进展的监测提供了一种简便、实用的新方法。    对于肿瘤的各器官及淋巴结转移的检出，以往只有在术中取材，进行病理学检查才能够确定7。而分子影像学提出应用报告基因的标记或报告探针即可解决这一难题，即通过报告基因或探针的成像，间接地反映出肿瘤细胞的转移情况。本实验是以GFP为报告基因

26、，但由于GFP蛋白所发出的绿色荧光穿透力差，无法透过较厚组织8，必须解剖暴露后成像才能观察到肿瘤的转移情况。因此尚需要进一步的研究，提高仪器的分辨率或应用发光强度更高的成像基因或荧光标记物质，才有望解决这一问题。    当前，关于肿瘤血管生成机制及抗血管生成治疗肿瘤研究已成为研究肿瘤的热点9。肿瘤新生血管的形成是血管内皮细胞肿瘤细胞和细胞外基质及微环境相互作用的结果10，11。如何获得肿瘤微血管生长情况一直是一项棘手的工作，传统的微血管密度计数法必须将动物处死、肿瘤组织切片作免疫组化12，而且应用于标记血管内皮细胞抗体如CD31、CD34、F等特异性不强，因而无法

27、直观、活体、动态连续观察肿瘤微血管生成情况。这就阻碍了我们对血管生成对肿瘤生长转移作用的理解，也影响我们研究抑制肿瘤血管生成药物的作用机制。本实验选择小鼠足背接种肿瘤细胞来观察血管生成情况，是因为该处组织相对透明，几乎无原宿主血管，表达GFP的肿瘤和其供血血管之间强烈的视觉反差，使此处的移植瘤内血管在荧光活体成像仪下清晰可见13；而且，可以在这些血管内研究肿瘤细胞的传输和增殖，还可以看到肿瘤细胞在血管内寄留，后者是肿瘤在休眠期的表现14。    此外，应用荧光活体成像还可以对抗肿瘤药物的疗效进行直观的评价，而不需将动物处死进行肿瘤大小的测量。在环磷酰胺（CTX）治

28、疗2周后通过活体荧光成像法和传统的抑瘤率测定法，同时对CTX的疗效进行评价，其结果基本一致。相比之下，活体荧光成像法无需将动物处死，可实时、连续地监测疗效，对于药效学研究以及临床药物疗效的判定具有极大的意义。    可以预见，分子影像研究今天的成果在未来510年内，对生命科学的各个领域将产生直接影响。分子影像学的开展使人们在分子水平对疾病机制及其特征有了更好的理解，并可以对肿瘤进行早期筛查、转移监测、抗血管生成及抗癌药物疗效的评估等方面的研究。如能够更好地应用肿瘤的特异性参数，如恶变前分子变异、生长动力学、血管生长因子、癌细胞标志物或遗传学改变，将会大大地提高其诊

29、断准确性和可靠性，并且提供比目前组织学检查等更快的三维信息；如将分子影像和基因治疗相结合，可在分子水平对治疗效果进行监控、评判，从本质上理解疾病的发生、发展过程，在接近分子水平更早和更直接地观察治疗效果，最终提高对疾病的早期诊断预防和治疗。     【参考文献】  1 Weissleder R,Mahmood U.Molecular imaging.Radiology，2001，219（2）:316-333.    2 Weissleder R.Molecular imaging:explori

30、ng the next frontier.Radiology，1999，212（3）:609-614.    3 Sugiura K.Studies in a tumor spectrum.The effect of mitomycinc on the growth of a variety of mouse，rat and hamster tumores.Cancer Res，1959，19（4）:438-495.    4 OReilly M,Holmgren L,Shing Y,et al.Angiostat

31、in :a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell，1994，79（4）:315-328.    5 Fichtner I,Tanneberger S.Preoperative （neoadjuvant） chemotherapy in the murine Lewis lung carcinome and possible implications for clicnical use.A

32、nticancer Res，1987，7（2）:227-233.    6 Yang M,Baranov E,Wang JW,et al.Direct external imaging of nascent cancer,tumor progression,angiogenesis,and metastasis on internal organs in the fluorescent orthotopic model.Proc Natl Acad Sci USA,2002，99（6）:3824 - 3829.    7 Farina KL,Wyckoff JB,Rivera J,et al.Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.Cancer Res，1998,58（2）:2528-2532. &