脉络膜新生血管动物模型的建立与评估

1、脉络膜新生血管动物模型的建立与评估【摘要】目的：评价氪激光诱导棕色挪威（brown norway, BN）大鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）模型的可行性。方法：BN大鼠32只一眼行氪激光（659nm）眼底光凝，另一眼作空白对照。激光功率、光凝斑直径和曝光时间分别为360mW、50m及0.05s。分别在光凝后7，14，21，28d随机选取7只大鼠行眼底照像、荧光素眼底血管造影（FFA）检查。随机选取1只大鼠行脉络膜血管铺片检查。眼球标本行组织病理切片光镜、免疫组织化学染色观察。结果：光凝后7d，CNV开始形成，21d达到高峰，1428d CN

2、V无明显变化。721d，FFA显示造影晚期荧光素渗漏及光镜下CNV厚度逐渐增加，28d时可能因瘢痕开始形成，故FFA渗漏和CNV厚度开始减少。结论：氪激光诱导BN大鼠的CNV模型是一种较为理想的模型，FFA及CNV厚度分析是CNV定量研究的有效手段。 【关键词】 氪激光；脉络膜新生血管；动物模型Establishment and quantitative analysis of animal model of choroidal neovascularizationXueJing Li, YouZhi Tang, HuiJuan Wang, Jun Feng, Li ZhangFoundati

3、on item: National Natural Science Foundation of China(No.30472229)Beijing Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, ChinaAbstractAIM: To investigate the feasibility of Krypton laserinduced choroidal neovasculation (CNV) model in the Brown Norway rats.METHODS: One eye

4、 of 32 rats received a series of 20 spots of laser irradiation (659nm, 360mW, 50m, 0.05s), the other eye were as controls. CNV was evaluated by fundus fluorescein angiography (FFA), high molecular weight FITCDextran (MW 2106) for high resolution angiography in RPEchoroidsclera flat mounts, and histo

5、pathologic examination was performed in 7, 14, 21 and 28 days after photocoagulation. RESULTS: CNV was firstly appeared on day 7 after photocoagulation, reaching the peak on day 21, no significant progress occurred in 1428 days. The fluorescein leakage and the thickness of laserinduced CNV were incr

6、eased from day 7 to day 21, were decreased in day 28. CONCLUSION: The Krypton laser induced model of CNV in the pigment rats may be useful, and the quantitative analysis of FFA and the thickness of CNV are useful for in vivo studies of angiogenesis and its modulation via various therapy.KEYWORDS: Kr

7、ypton laser; choroidal neovasculation; animal model0引言 脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）又称视网膜下新生血管（subretinal neovascularization, SRNV），是导致年龄相关性黄斑变性、中心性渗出性脉络膜视网膜病变和高度近视等多种眼底疾病视力丧失的主要原因。探讨CNV的发病机制与有效治疗是目前国内外学者的研究热点。我们应用659nm氪激光光凝棕色挪威（brown norway, BN）大鼠视网膜，旨在建立一种可行的CNV模型，并采用几种常见的评价CNV变化的观察手段

8、对该模型进行评估，以探讨CNV生成及变化情况。1材料和方法1.1材料清洁级BN大鼠32只，911周龄，体质量200250g，雄性，由北京维通利华实验动物有限公司提供。实验前双眼前节和眼底检查均正常。盐酸奥布卡因滴眼液（商品名倍诺喜，日本参天制药株式会社），复方托吡卡胺滴眼液(北京双鹤现代医药技术有限责任公司)，100g/L水合氯醛溶液(解放军总医院)；10g/L甲基纤维素滴眼液(解放军总医院)；200g/L荧光素钠注射液 (广西梧州制药股份有限公司)；兔抗因子多克隆抗体(福州迈新公司)；SP试剂盒及AEC显色试剂盒（福州迈新公司）；异硫银酸荧光素葡聚糖(上海联合利华公司)。氪激光机(美国Coh

9、erent公司，型号为Novua 2000)；共焦激光眼底血管造影仪(德国Heideberg公司)；光学显微镜 (德国Leica公司，MPS 30)；激光共焦荧光显微镜(美国Bio Rad公司，MRA/2型，配置日本Nikon公司E600荧光显撇镜)。1.2方法实验前 15min大鼠100g/L水合氯醛溶液3.5mL/kg行ip，双眼复方托吡卡胺散瞳。大鼠实验眼结膜囊内滴适量倍诺喜、10g/L甲基纤维素后，眼前放置一53.00D的接触镜，用波长为659nm氪激光光凝视网膜，光斑能量输出功率360mW，直径50m，曝光时间0.05s，距视盘1.52.0PD处、避开血管、环绕视盘光凝2排，以光凝后

10、有气泡产生或伴有轻度出血（有时伴有轻响）标志击破Bruch膜，记为有效点。共20个激光斑。按随机数字分为氪激光光凝视网膜后7，14，21和28d共4组，每组8只大鼠。右眼为实验眼，左眼为对照眼。1.2.1荧光素眼底血管造影麻醉等准备工作同前。分别于光凝后7，14, 21和28d，将100g/L荧光素钠1mL/kg ip，行眼底荧光血管造影(fundus fluorescence angiography，FFA )检查。1.2.2脉络膜血管铺片检查分别于光凝后7，14，21和28d各取1只大鼠，100g/L水合氯醛麻醉大鼠后，将大鼠仰卧位固定，于胸骨中线左侧23mm剖开胸腔，防止过多出血。迅速剪

11、开肋骨，打开横隔膜，暴露心脏。小心将23号头皮针刺入左心室，剪开右心房排液，缓慢但持续经心脏注入含肝素钠生理盐水10mL，此后，改为0.1mol/L PBS (pH7.4)灌注，当多数血液已流出、流出液不见血色(约300mL/kg)后，改成用FITCD乳酸盐林格氏液20mL(内含FITCD 100mg，明胶2g)缓慢灌流固定大鼠。大鼠四肢及尾部出现肌肉颤动，表示灌流成功。灌流结束时，大鼠僵硬。摘除眼球后避光置于冰块冷冻10min，此后避光保存固定于40g/L的多聚甲醛中1h，显微镜下沿赤道部打开眼球，去除眼前节，小心揭除神经视网膜层，获得视网膜色素上皮层（RPE）一脉络膜一巩膜复合体标本，做4

12、6条放射状切开后将RPE面向上放置在载玻片上。乙醇脱水，二甲苯透明。利用激光共焦荧光显微镜对RPE脉络膜一巩膜复合体进行观察和测量。以488nm激光激发样品，收集530nm荧光信号。计算机采集数字图像（软件Laser Scanning Microscope Fluoview Version 4.3）。1.2.3病理学检查大鼠于FFA检查后2d过量麻醉处死，立即摘除眼球，置于40g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定24h。经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，平行于角膜至视盘的矢状位连续4m切片切至激光斑处。常规HE染色。因子相关抗原免疫组织化学检测按试剂盒说明书进行，采用SP法染色，AEC显色，经苏

13、木素复染后封片。兔抗人因子多克隆抗体的工作浓度为150。着色部位为胞质呈紫红色染色。1.2.4 CNV判定取造影晚期像（FFA5min）观察CNV形成渗漏情况。计算机图像分析系统计算每个时间点CNV的荧光素渗漏积分面积。CNV厚度通过光镜200倍视野下取连续切片中CNV区域内色素上皮层至视网膜内最高点的最大距离，每个时间点取20张切片进行测量，取平均值。 统计学分析：ImagePro Plus 6.0图像分析系统对FFA荧光素渗漏、脉络膜铺片CNV面积和厚度进行测量。所得数据用均数标准差 (s)表示。采用 SPSS 13.0统计软件包对数据进行正态性检验、方差齐性检验后用单因素方差分析的方法，

14、其均数的两两比较用SNK检验，P0.05为有显著性意义。2结果2.1眼底彩照和FFA观察氪激光光凝BN大鼠视网膜时，光凝斑中央可见气泡形成，光凝后即刻光凝斑部呈强浓白，外围灰圈，视网膜水肿 (图1A)。有时视网膜内层或视网膜下少量出血。正常BN大鼠FFA，视网膜血管充盈呈放射状，脉络膜血管充盈并融合成弥漫的背景荧光，无荧光素渗漏。光凝后 7d，光凝区FFA早期即出现荧光素渗漏，晚期渗漏呈圆盘状 (图1B)。光凝后 14d，光凝区可见荧光素渗漏增加。光凝后 21d，光凝区可见更多的荧光素渗漏，荧光强度也进一步加强达高峰(图1C)。光凝后28d，荧光素渗漏程度与21d相比略有减少。7d时CNV渗漏

15、面积为38674.8，为最少；21d时为91457.19，达高峰。光凝后7d与14，21和28d相比差异有显著性意义(P0.05，表1)。表1 光凝后不同时间荧光素渗漏面积和CNV厚度（略）2.2脉络膜血管铺片观察激光共焦扫描显微镜下见光凝后7d在光凝斑边缘及光凝斑中心的深部脉络膜血管可见FITC显影（图2A），光凝后21d见光凝斑深部明显CNV来源于深部脉络膜血管，朝向视网膜神经层生长，CNV与周围的脉络膜比较呈网状高荧光斑（图2B）。但CNV的面积因背景荧光明显，故测算不准确。2.3 HE染色结果正常BN大鼠眼视网膜及脉络膜各层组织结构清晰、完整。实验眼光凝后7d光斑处RPE层和Bruch

16、膜明显破坏，外核层破坏或缺损，内核层排列紊乱，视网膜水肿，增生细胞自脉络膜穿过破损的Bruch膜和RPE层向视网膜内层增生，形成早期的CNV，呈纺锤形，CNV厚度为39m，其中可见中性粒细胞、巨噬细胞和迁移增生的RPE细胞（图3A）。光凝后14d CNV进一步增生，CNV厚度为53m，中性粒细胞和巨噬细胞减少，成纤维细胞和胶原纤维增多，RPE细胞迁移增生包绕新生血管。此后，CNV进一步增生，至21d达到高峰，CNV厚度为55m，但21d时CNV厚度与14和28d相比无明显变化（图3B，表1）。2.4 CNV中因子相关抗原表达因子标记用于显示血管内皮细胞的迁移增生和新生血管的形成。正常视网膜内核

17、层微血管及神经纤维层大血管、脉络膜毛细血管内皮细胞可见因子抗原染色呈紫红色，其他部位无阳性表达。光凝后7d光凝区视网膜下间隙散在阳性染色细胞（图4A），光凝后14d光凝区视网膜下阳性染色细胞逐渐增多至21d时，已经可见阳性细胞围成管腔（图4B）。3讨论 目前，建立CNV动物模型的方法繁多，主要有激光诱导、生长因子诱导、炎症诱导、缺氧诱导、氧化损伤诱导和手术诱导的在体动物模型及脉络膜植片体外培养的离体动物模型。这些动物模型各有其优缺点，但尚无一种模型可以完全模拟人类CNV的发展过程1,2。通过高能量激光光凝视网膜，随后发生损伤修复反应，光凝区内CNV形成，是目前国内外普遍使用的CNV动物模型，经

18、常用于观察血管生长因子的表达水平、研究基因敲除特异性基因的作用、评价抑制剂和药物以及光动力疗法等对CNV的治疗效果等35。但是，激光器的种类不同，使用的参数亦有不同。既往曾有人使用氪激光（647nm），参数为光斑能量输出功率250mW，直径50m，曝光时间0.05s，在距视盘1.52.0PD处，避开血管，环绕视盘光凝1排10点成功诱发出小鼠CNV模型1，本实验考虑到大鼠视网膜面积较小鼠大、视网膜神经纤维层厚度较小鼠厚，将原参数光斑能量输出由250mW更改为360mW，将原光凝10点改为环绕视盘光凝2排（20点）亦成功诱发出BN大鼠的CNV模型，该模型同其他激光器诱发出的CNV大鼠模型在FFA渗

19、漏发生、CNV厚度变化等情况一致6，可以作为理想的动物模型做进一步的中药干预观察研究；而且该模型在7d后即有CNV形成，渗漏高峰在1428d，成模速度快、维持时间较长且稳定，且该模型将激光点数增加，使样本量加倍，更有利于病理切片的制备，更利于相关指标的测算。观察评价CNV的方法主要有活体的影像学检查和组织病理学检查。活体的影像学检查主要有FFA、吲哚氰绿血管造影（ICGA）、光学相干断层扫描（OCT）观察等。FFA是用来动态监测CNV形成过程的主要手段，是较组织学方法快速和简便的观察手段。新生血管在造影早期就出现荧光，晚期伴有荧光素渗漏，根据荧光素渗漏程度可判断CNV形成的大小。ICGA与FF

20、A显示的CNV病变部位一致，对黑色素、出血及渗出物的穿透力更强，但荧光效应弱，为荧光素钠的1/25，显示的图像没有FFA清晰，故本文仅选择了FFA作为观察CNV的指标，但应注意FFA上的荧光渗漏与真正的血管渗漏之间的关系不清楚，只能作为间接反映CNV渗漏的指标，组织学方法才是判断CNV形成的“金标准”。OCT检查由于鼠眼较小，操作困难，故未采用。FITC右旋糖酐标记CNV的技术原理为高相对分子量的FITC右旋糖酐（2106）固定后能滞留在血管内，FITC可被激光激发表现出绿色荧光从而标记出CNV，该方法可以成功标记缺氧诱导的鼠血管增生性视网膜病变模型中视网膜铺片上的新生血管7。后来，这种方法被

21、Edelman等3证实，可以用于评估CNV。但是，在我们的实验中发现该方法不稳定，有的图片可以清晰辨认CNV（图4B），有的图片在光凝斑处未见到CNV，却有明显的背景荧光遮蔽（可能是光凝造成的组织损伤形成的脂褐素样物质发出的自发荧光造成的），因此，CNV的面积测量不够准确，在实验中仅将其作为一形态学指标加以描述，未计入统计学分析。组织学方法需要大样本，可以利用光镜、电镜、荧光显微镜及共聚焦显微镜从不同水平观察。我们选择HE染色大体观察CNV的大小，通过每眼连续切片中直径最大和中央厚度最大的切片作为对该眼CNV评价的指标，经统计分析与杨秀梅等8的结果一致，说明该动物模型具有良好的可重复性，而且，进一步通过因子抗原标记血管内皮细胞，证实确有CNV形成，下一步拟通过大样本因子抗原标记物的累积光密度分析看CNV的密度变化情况。我们发现，尽管28d与7，14d相比，FFA渗漏面积和CNV厚度无统计学差异，但与其他学者6,8的研究结果不一致，28d已经表现出下降的趋势，考虑与光凝20点后诱发更为强烈的损伤反应，使随后的愈合反应加速进行有关。因此，为避免自发的创伤愈合反应对实验结果的影响，我们将观察周期截止至28d。 总之，氪激光诱导的BN大鼠模型是一有效的CNV模型，因子