利用细菌防治大豆根腐病菌及胞囊线虫病研究

1、利用细菌防治大豆根腐病菌及胞囊线虫病研究 基金项目：科技部成果转化基金项目（05EFN212100059），农业部成果转化基金项目，国家自然科学基金（30673199）段玉玺 陈立杰 王媛媛 孙华 李进荣（沈阳农业大学 北方线虫研究所 沈阳 110161）摘要：细菌是大豆根际微生物多样性中的重要成员,利用有益细菌菌株作为生防因子是解决土传微生物病害的重要途径。本文对部分细菌菌株对大豆根腐病菌及大豆胞囊线虫的抑制效果进行了研究。结果表明，部分菌株对大豆根腐病原菌-瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）抑制效果明显，但对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）抑制效果

2、不明显；获得了7株对大豆胞囊线虫胞囊孵化具有抑制效果的菌株。在田间筛选过程中从1069株细菌中筛选获得14株菌株，这些菌株包衣处理大豆种子表现对大豆胞囊线虫胞囊的形成有抑制作用。这些菌株有可能成为非常有应用前景的生防菌株。关键词：细菌；大豆胞囊线虫；大豆根腐病Bio-Effect of Different Bacterial Strains on Soybean Root Rot Pathogens and Heterodera glycines Duan Yu-xi Chen Li-jie Wang Yuan-yuan Sun Hua Li Jin-rongNematology Instit

3、ute of Northern China, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,CinaAbstract: The bacteria was the important member among the microorganism biodiversity. It was the best ways to use the bacteria as the bio-agent to control the soilborn pathgens. The biocontrol effects of different bacteria

4、on the soybean root rot pathogen (Pythium aphanidermatum and Fusarium oxysporum ) and Heterodera glycines were tested in this paper. The results showed that some strains had effect on the Pythium aphanidermatum, but no effect on Fusarium oxysporum. Seven bacterial strains were obtained which could s

5、uppress the hatch of H. glycines. The 14 bacterial strains were selected from 1069 bacterial strains by field selective assay which could disturb the cyst formation on the surface of soybean root. The bacterial strains which had effect on the fungal pathogen and nematode would be become the bio-cont

6、rol agents on the soybean root rot pathogen and soybean cyst nematode in the future.Key word: bacteria; Heterodera glycines; soybean root rot大豆胞囊线虫病（soybean cyst nematode, SCN），又称大豆黄萎病、火龙秧子，长期以来是制约大豆生产的重要病害。该病害一般使大豆减产10%30%，严重地块可达70%90%，甚至造成绝产，比任何一种单一病害所造成的危害都大。此病害在我国东北三省、内蒙古和黄淮海大豆主产区严重发生，是一种极难防治的土传

7、病害。从世界范围来看，SCN的为害和蔓延有日益加重的趋势。大豆根腐病是一种世界性病害，分布范围广，在世界各大豆产区均有发生，我国主要分布在东北和黄淮海大豆主要产区。大豆根腐病造成严重的产量损失，仅在黑龙江垦区发病率达到7590，减产10-20左右。而且大豆根腐病的病原菌种类包括以镰刀菌为主的多种病原菌，这个特点使这种病害的防治显得尤为困难。大豆根部的这两种主要病害都是是典型的土传病害，土壤条件的复杂性使得各种防治措施均有其局限性，不能很有效的控制该病的发生。目前在我国的各大豆主产区的大豆生产不仅不能重茬，迎茬的大豆根病更重。大豆根病的生物防治越来越受到人们的重视。利用细菌作为生物防治因子防治植

8、物病害已成为国内外在生物防治研究中的一个热点。根际细菌（rhizobacteria）是从根际分离的细菌，依据其对植物的作用，分为有益菌、有害菌和中性菌等3类。有益根际菌又被称为促生根细菌（plant growth-promoting rhizobacteria简称PGPR），PGPR指与根有密切关系并强定殖于根系，能促进植物生长的根际细菌。1991年，Sikora提出用PHPR（plant health-promoting rhizobacteria）代替PGPR来定义那些对植物寄生线虫有抑制作用的根际细菌。国内外研究者对植物根际细菌进行了大量的筛选，发现了一些对植物寄生线虫有拮抗作用的生防细

9、菌（Siddiequi and Mahmood, 1999），其中以假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌属Bacillus中的种类最多。Tian和Riggs（2000）在温室试验中发现，201个细菌菌株中有138个对胞囊、卵+二龄幼虫的数量没有影响，36个菌株减少胞囊、卵+ 二龄幼虫的数量，27个菌株增加胞囊、卵+ 二龄幼虫的数量。其中5个菌株与对照相比，能稳定地减少大豆胞囊线虫的数量。我国是大豆的原产国，大豆根际微生物多样性非常丰富，利用和筛选有益细菌控制大豆胞囊线虫病和大豆根腐病是可持续农业的发展方向。1 材料与方法供试品种：辽豆10大豆，辽宁省农科院提供。供试线虫：大豆胞囊线虫(H

10、eterodera glycines)3号生理小种。供试菌株：瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum） 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）大豆根腐病菌平板对峙试验：采用双向培养法（方中达，1998），在PDA平板中心接种大豆病原菌菌片（直径5 mm），四周2 cm处接细菌菌株，以不接细菌平板为空白对照，每处理3次重复，25下培养2-4D，待空白对照病原菌充分长大，测量抑菌圈的大小。胞囊孵化抑制试验：取新鲜饱满的胞囊，无菌水浸泡过夜，0.5%NaOCl表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，放入孵化池。孵化池为双层玻璃套管，在双层玻璃套管间夹入纯棉滤纸，121下灭菌

11、5 min。将孵化池置于无菌培养皿中，向培养皿内加入内生细菌菌悬液1 mL(109CFU/mL)，再向其中加入无菌水9 mL，以未加细菌菌悬液的无菌水处理为空白对照，3次重复，25下孵化。9天后观察计数孵化出的J2数量。种子处理方法：将实验室保存的细菌菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中于25下培养3d, 然后配成109CFU/mL的菌悬液，加入适量的吐温100，采用1%的种子量进行种子包衣处理，待干燥后装袋、编号备用。田间小区处理：采用田间自然发病土接种大豆。分别在辽宁省康平县和黑龙江省哈尔滨市两地进行4次重复试验。大豆田为重茬大豆田，采用5点取样测定田间胞囊量分别为35个胞囊/100mL土壤和4

12、0个胞囊/100mL。田间调查：在大豆出苗后35天待大豆胞囊线虫生长发育突破大豆根表后进行调查单株大豆根系胞囊着生量，在大豆叶片全部脱落时测定大豆生长情况。调查结果采用SPSS分析软件进行分析。2 结果与分析2.1不同细菌菌株对大豆根腐病菌的影响通过对峙培养试验，结果表明部分菌株对大豆腐霉根腐病菌的抑制效果明显，但对尖孢镰刀菌的抑制效果不明显。表 1不同细菌对瓜果腐霉菌（P. aphanidermatum）菌丝生长的抑制效果（mm）*Table 1 The antagonistic effect different bacteria of to P. aphanidermatum(mm)菌株S

13、trains抑菌圈直径Diameter of inhibited halo细菌菌落直径Diameter of strains抑制率()Inhibiting rateNemab55334475.60%Nemab56133873.34%Nemab56931869.90%Nemab928181240.00%CK90-注：*培养2天的测定结果 Note：*Treatment after 2 dNemab553Nemab569Nemab928CKNemab561CKCKCK图版1 不同菌株对瓜果腐霉菌（P. aphanidermatum）菌丝生长的抑菌效果(A. Nemab553; B. Nemab56

14、1; C. Nemab569; Nemab928)Plate 1 Antigonist of strains of different bacteria against P. aphanidermatum 图版2 菌株Nemab510与尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的对峙培养结果Plate 2 Antigonist of strains Nemab510 against F. oxysporum22不同细菌菌株对大豆胞囊线虫孵化的影响 不同细菌菌株对大豆胞囊线虫孵化的影响差异明显。其中7株菌株对大豆胞囊线虫孵化抑制率明显高于对照。其中菌株r030348对大豆胞囊线虫孵化的抑制率达84.

15、8%。表2 不同细菌菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化的影响*Table 2 The effect of different strains of bacteria on the hatching of cyst处理菌株Strains孵化出的线虫数（条）The J2 number of hatching相对抑制率Suppression ratio（%）IIIIII平均r030060r030066r030121r030260r030348r030361r030398对照CK3043204554633963242145252635742894428535306830.0Bb*31.0Bb26.0Bb26.

16、0Bb11.7Bc35.7Bb32.7Bb79.3Aa62.2%60.8%67.5%67.5%84.8%54.4%58.8%注：*处理9 d后的结果*数字后字母为Duncans新复极差测验结果，不同大、小写英文字母分别表示差异极显著（P<0.01）和差异显著（P<0.05）。注：*Treatment after 9 d*The letters in table were the results of Duncans test. Capital and small letter indicated P<0.01 and P<0.05 separately. 23 不同细菌

17、菌株对大豆胞囊线虫繁殖的影响通过对1069株细菌菌株处理的大豆，在大豆胞囊线虫显囊期调查不同处理根系胞囊着生情况，其中有14株细菌菌株经包衣大豆种子处理对大豆胞囊线虫的胞囊形成有明显的抑制效果（见表2）。其中部分菌株辽宁和黑龙江两地处理的结果有一定差异，这与国外报导的研究结果相似（Tian 和 Riggs,2000）。表2 采用不同细菌菌株包衣处理大豆种子对大豆根系胞囊形成的影响Table 2 The effect of cyst numbers of Heterodera glycines per soybean plant root which the seeds coated by di

18、fferent bacterial strains 处理Treatment辽宁Liaoning黑龙江Heilongjiang平均单株胞囊数Cyst Number per Plant胞囊抑制率%Suppression ratio平均单株胞囊数Cyst Number per Plant胞囊抑制率%Suppression ratioCK30.0-27.5-Nemab1275.083.317.436.7Nemab1766.678.013.052.7Nemab18413.056.713.849.8Nemab2467.076.76.078.2Nemab2931.296.03.089.1Nemab3068.

19、472.02.989.5Nemab3072.093.311.159.6Nemab3094.086.73.985.8Nemab3111.598.311.857.1Nemab3206.678.05.281.1Nemab3230.897.34.583.6Nemab3423.688.09.366.2Nemab4006.279.30.897.1Nemab4020.897.316.041.83 结论 细菌是大豆根系生长环境中生物多样性的重要成员，如何有效利用生物多样性控制土传植物病害是国际植物保护研究领域的热点。本研究结果表明，在众多细菌中，某些成员对大豆真菌性根腐病病原具有一定的拮抗作用，特别是对腐霉菌的拮抗作用较为明显。其中部分细菌菌株对大豆胞囊线虫的卵的孵化也有明显的抑制作用。通过对大豆种子进行包衣处理，其中有14株细菌对大豆胞囊线虫雌虫的形成有明显的影响，根表形成胞囊数显著减少。本研究筛选获得的菌株有可能成为控制大豆根腐病和大豆胞囊线虫非常有前途的生防菌株。参考文献：1段玉玺，陈立杰. 2006. 大豆胞囊线虫防治技术M. 金盾出版社, 北京.2刘维志. 1995. 植物线虫学研