基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定（前提）（前提）（核心）（核心）（关键）（关键）（保证）（保证）一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、

2、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类: :种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库（先建立基因文库，再从中筛选；）（先建立基因文库，再从中筛选；）提取某种

3、生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库3 3、构建基因文库、构建基因文库（1 1）构建基因组文库）构建基因组文库某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）构建）构建cDNAcDNA文库文库3.3.构建基因文库构建基因文库基因组文库

4、和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，中不是直接保管相应基因，而是而是保存受体菌保存受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。4 4、从基因文库直接获取目的基因、从基因文库直接获取目的基因怎样从基因文库中获取目的基因呢？怎样从基因文库中获取目的基因呢？（1 1）获取目的基因的根据：）获取目的基因的根据：如：根据基因的核苷酸序列；如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置； 基因的转录产物基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。4 4、从基

5、因文库直接获取目的基因、从基因文库直接获取目的基因（2 2）用）用DNADNA探针探针从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。4 4、从基因文库直接获取目的基因、从基因文库直接获取目的基因（2 2）用）用DNADNA探针探针从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。也可以用也可以用PCR方式从基因文库中获取目的基因方式从基因文库中获取目的基因为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生

6、物体内提取不行吗？生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。式。如果所需要的目的基因序列已知如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过，就可以通过PCR方式方式从含有该基因的生物的从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录中，直接获得，也可以通过反转录，用，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。中获得，不一定要构建基因文库。但如果但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段的一段，或想从一种生物体内获得许多

7、基因，或者想知道这，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便合成引物

8、。以便合成引物。原理：利用原理：利用DNA双链复制原理双链复制原理n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至55556060部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至70707575在在TaqTaq酶作用下，酶作用下，合成互补的新合成互补的新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸注意：双链注意：双链DNA中，中，G和和C比例越高，比例越高，DNA变性温度越高。变性温度越高

9、。（二）、利用（二）、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制有一段已知基因的核苷酸序列有一段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物耐热的耐热的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n

10、使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增二、利用二、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（复性、退火（复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补引物处延伸，合成与模板互补 的的_

11、。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水解引物水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料、能量、酶、引物等模板、原料、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断氢键在高温下断裂，双链全部解裂，双链全部解开开解旋酶催化氢

12、键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等结果结果在短时间内形成在短时间内形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子 33.(8 33.(8分分) )请回答基因工程方面的有关问题：请回答基因工程方面的有关问题： （1 1）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNADNA复制复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链类似（如下图所示）。图中引

13、物中为单链DNADNA片段，它是子片段，它是子链合成延伸的基础。链合成延伸的基础。“汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片段片段所占比例为所占比例为 。 在第在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的长

14、的DNADNA片段。片段。15/16 三三 “汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始P

15、CR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束 （2 2）设计引物是）设计引物是PCRPCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。别说明理由。第一组：第一组：_引物引物I和引物和引物II局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效 引物引物II自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效“汉水丑生的生物同行

16、汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。“汉水丑生的生物同行汉水丑生的生物同行”超级群大型超级群大型公益活动：历年高考题公益活动：历年高考题PPT版制作。版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。以任何形式用于商业目的。2012年年1月月15日，汉水丑生标记。日，汉水丑生标记。（三）、人工合成目的基因（三）、人工

17、合成目的基因（在在DNA合成仪中合成）合成仪中合成）基因比较小，核苷酸序列已知基因比较小，核苷酸序列已知二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子编码区编码区： 能转录，编码蛋白质能转录，编

18、码蛋白质非编码区：非编码区： 不编码蛋白质不编码蛋白质, ,能调控遗传信息表达能调控遗传信息表达真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子内含子 外显子外显子 与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点编码区编码区：非编码区：非编码区：外显子：外显子： 内含子：内含子： 能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子启动子启动子原原核核真真

19、核核基因的结构基因的结构原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的2、表达载体的组成、表达载体的组成1.1. 启动子启动子2.2. 终止子终止子3.3. 目的基因目的基因4.4. 标记基因等标记基因等质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种3.3.过程过程:

20、 :载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受

21、体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意1、构建重组质粒时，需用、构建重组质粒时，需用 切割切割含目的基因的含目的基因的DNA和载体。目的是和载体。目的是 。切割含目的基因的切割含目的基因的DNA和载体并非只能用同一种限制酶。和载体并非只能用同一种限制酶。2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？、目的基因与载体成功连接的基础是什么？4、目的基因的插入位点不是随机的。、目的基因的插入位点不是随机的。目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段，目的基因的插入不能破坏载体

22、上自身需要的基因片段，以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。以及其上的标记基因，且插入在启动子和终止子之间。5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差异。差异。基因工程载体的构建需要考虑的因素：基因工程载体的构建需要考虑的因素：（1）基因的特点：基因的特点：若来自动物的目的基因含有内含子，若来自动物的目的基因含有内含子，不能用于转基因植物；不能用于转基因植物； 若基因产物是糖蛋白，该基因在原核生物中若基因产物是糖蛋白，该基因在原核生物中的表达蛋白不具备天然的活性；的表达蛋白不具备天然的活性；（2）要选择强启动子或组织特异性启动子；要选择强启动

23、子或组织特异性启动子；（3）要有选择标记基因；要有选择标记基因；三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化（一）转化 （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2+Ca2+处理法处理法目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方

24、法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点：经济、有效优点：经济、有效（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注方法：显微注 射射 法法程序：程序：3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单

25、细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 大肠杆菌大肠杆菌四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 .首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个