第七章-发酵染菌与防治

1、n防止发酵生产中杂菌污染有着重要的意义：1、保证发酵产品的质量、收率的温度2、保持发酵生产正常有序的进行3、有利于节约型社会的建立一、发酵异常现象及染菌分析（一）种子培养基和发酵的异常现象1、种子培养基异常出现菌体生长缓慢的原因是：1、种子自身的原因，菌种使用时间过 长，传代频繁、菌体老化及接种量少2、培养基的原因：批次间原料成分波动大。种子培养基营养缺乏3、操作过程中的原因，培养基灭菌不彻底、供氧不足等原因出现菌丝结团的原因是：通气不足、溶氧条件差、搅拌的剪切力力过大、培养基质量下降等原因出现代谢不正常的原因是：培养环境差、接种量少、杂菌污染等原因2、发酵异常 1、菌体生长差2、PH异常3、

2、溶解氧水平异常4、泡沫过多5、菌体浓度过高或过低n（二）染菌隐患检查n发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据。无菌试验方法主要有：显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程中的异常观察法。n（三）发酵染菌原因n总结为发酵工艺流程中的各环节漏洞和发酵过程中管理不善两方面。n各环节漏洞包括：1、培养基灭菌不彻底2、无菌空气带菌3、种子带菌4、消泡剂带菌5、工艺用水带菌6、管道及附属设备或罐体出现渗漏或死角7、泡沫逃溢8、批次发酵后清洗不彻底等n 发酵过程中管理不善：1、工人的培训不到位导致操作上的认识2、发酵车间卫生环境差3、设备未定期检修4、管理制度不完善n（四）染菌原因分析n1、染菌杂菌

3、分析表7-5n2、发酵染菌的规模分析n大批量发酵罐染菌：n个别发酵染菌：大都是由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体、管路是否清洁。n3、不同污染阶段分析：1、染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌2、在发酵过程中的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌3、发酵后期染菌大部分由空气过滤不彻底，中间补料染菌，设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题引起。n（五）染菌隐患处理n 在正式发酵之前必须做到以下几点：1、严格按照生产工艺要求的各项指标、参数、条件进行操作2、投产前进行整个发酵系统的无菌测试3、严格工人的管理，实行操作记录制度4、加强在线加测的技术手段，各种生物传感器、探头要定期校正5、定期对设备进

4、行检修n二、染菌对发酵的影响n（一）染菌对不同发酵过程的影响n（二）杂菌的种类和性质对发酵过程的影响n（三）染菌发生的时间不同对发酵的影响：1、种子培养期染菌2、发酵前期染菌3、发酵中期染菌4、发酵后期染菌n（四）染菌程度对发酵的影响：染菌程度越大，发酵罐内的杂菌量越多，对发酵的危害也就越大，如果染菌严重尤其是发酵的前期、中期，对发酵的影响是非常严重的。n三、染菌污染后的挽救和处理n（一）种子培养期染菌的处理：若发现种子罐被杂菌污染，应立即停止向发酵罐内在输送种子，进行灭菌后排放，然后对种子罐连接的物料管道、供气管道进行彻底的灭菌，与此同时，采用未受污染的正常种子接入发酵罐中，以保证生产的连续

5、性，如无备用的种子，则可以选择一个适当菌领的发酵罐中的发酵液作为种子，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证生产的正常进行。n（二）发酵前期染菌处理：1、发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵2、如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可以放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵3、也可采取降温培养、调节PH、调整补料量、补加培养基等措施进行处理n（三）发酵中后期染菌处理1、发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以适当加入杀菌剂或抗生素以及正

6、常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低风量、停止搅拌、少量补糖等措施，进行处理2、如果发酵过程的产物代谢已到达一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐3、对没有提取价值的发酵液，加热后排放n（四）染菌后对设备的处理：必须放罐后进行彻底清洗，空罐加热灭菌至120以上、保持30min才能使用n四、污染的防治策略n（一）强化空气处理过程：1、空气净化流程2、过滤介质选择3、过滤介质的填装4、空气净化系统的管理n（二）严格培养原料及设备的灭菌n1、原料预处理n原料除杂目的：为了清除谷物或水果原料中的土块、石块、掉落的铁质零件，以免使机械收到磨损，发生故障。影响后

7、面的发酵工序n粉碎的目的：为了增大原料的比表面积，减少固体的团块n浸泡的目的：为了使原料与水充分接触，进而使营养物质便于菌体的利用n2、培养基的灭菌n灭菌要求：在保证杀灭杂菌的前提下，尽可能多的保留营养物质n3、设备灭菌n一、实罐灭菌。应该充分排净发酵罐内的冷空气二、对设备死角的处理1、法兰连接的死角2、渣滓在罐底用环式空气分布所形成的死角3、不锈钢衬里的死角4、接种管路的死角5、排气管的死角6、不合理补料管配置造成的死角7、压力表安装不合理形成的死角n（三）定期检测设备及管道n1、发酵设备的定期检查：机械密封在发酵罐上得到广泛的应用n2、管道、阀门的定期检查：使用最多的是截止阀，阀门分为公称

8、级、低漏级、蒸汽级和原子级n（四）严格培养物的移接n1.无菌室n配合使用化学灭菌药剂有：75%酒精、0.6%-0.1%漂白粉、0.5%高锰酸钾等n无菌室无菌度的要求：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30min，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好n2.灭菌锅n注意：排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞n3、接种用具要求：1、新购置的玻璃仪器的处理2、移种前的操作3、移种操作过程的要求n（五）预防噬菌体的危害n噬菌体是：原核生物的病毒、非常微小，其直径为0.1微米n噬菌体繁殖过程一般分为五个阶段：噬菌体吸附到寄主细胞上，噬菌体的头部核酸通过尾

9、管注入到寄主细胞中，以寄主细胞内的物质为原料，复制合成噬菌体自身的部件，完成组装，分泌酶水解细胞壁使细胞破裂。n1、症状：发酵液光密度不上升或回降；PH逐渐上升，氨利用停止、糖耗、温升缓慢或停止，产生大量的泡沫，使发酵液呈黏胶状n2、原因是环境污染为主。环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的只要根源n3、防治：1、定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体2、检查生产系统，消除各种不安全因素3、选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株n应急挽救措施 1、加入少量药物以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质合成及增殖2、当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子3、大量补接种子液或

10、重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵至终点五五 食用菌及生物农药生产中应注意的染菌问题食用菌及生物农药生产中应注意的染菌问题1、食用菌生产中的染菌危害、食用菌生产中的染菌危害A细菌细菌n谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。染杂菌，但噬菌体威胁大。n肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。代谢产物。B. 霉菌霉菌nPenG：青霉素水解酶上升，：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，迅速破坏，发酵一无所获

11、。发酵一无所获。n柠檬酸：柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染，不易染菌，主要防止前期染菌。菌。C. 酵母菌酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。都应全部废弃。（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响（2）染菌种类对发酵的影响染菌种类对发酵的影响n青霉素：怕染细短产气杆菌青霉素：怕染细短产气杆菌n链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌n四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜

12、杆菌n柠檬酸：怕染青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌n肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌n谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响n种子扩大时期染菌种子扩大时期染菌: :n发酵前期染菌发酵前期染菌：n发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 n抗生素发酵抗生素发酵 n柠檬酸发酵柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0

13、，抑制，抑制细菌细菌 b. 污染酵母：加入污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；抑制酵母；通风加大，加速产酸。通风加大，加速产酸。 灭菌后弃去灭菌后弃去应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响n柠檬酸发酵柠檬酸发酵c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下下降，黄曲霉自溶。降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。n发酵发酵后期污染后期污染n染菌量不太多，可

14、继续发酵染菌量不太多，可继续发酵n污染严重，则提前放罐污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价发现后加入，效果要具体评价（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响n丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀凝剂使蛋白质凝聚后沉淀n杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处

15、理过程中采杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化极易发生乳化1.1.染菌的不良后果染菌的不良后果 n消耗营养消耗营养n合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难n改变改变pHn分解产物分解产物n噬菌体破坏极大噬菌体破坏极大1. 染菌的检查与判断染菌的检查与判断n显微镜检查法显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间n平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可

16、采用双层平板法：噬菌斑n肉汤培养检查法肉汤培养检查法 n发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断nDO2水平异常变化水平异常变化npH异常变化异常变化n尾气尾气CO2异常变化异常变化 122. 污染原因分析污染原因分析 n主要原因：主要原因： 种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善n n从污染时间看：早期污染可能与从污染时间看：早期污染可能与接种操作接种操作不当有关；后期污染可能与不当有关；后期污染可能与及中间补料有关。及中间补料有关。n从杂菌种类看：从杂菌种类看：n耐热芽孢杆菌：与耐热芽孢杆菌：与有关

17、有关n球菌、无芽孢杆菌：与球菌、无芽孢杆菌：与 有关有关n浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏n霉菌：与霉菌：与有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题题n酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 n从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。罐连续染菌，一般是设备问题。2. 污染原因分析污染原因分析 n2、生物农药生产中的

18、染菌问题、生物农药生产中的染菌问题n生物农药定义：又称生物源农药，指直接利用自然界有益的生物从某些生物中制取的具有杀虫、防病等作用的生物活性物质n两类：一类是活体生物农药，另一类是代谢产物生物农药n生物农药发酵生产包括：苏云金芽胞杆菌发酵、白僵菌等发酵n生产中要注意的问题：保持菌种优良的性状，定期检查无菌空气制备系统，严格菌种移接的程序，发酵过程中控制罐压及泡沫状况，防止染菌。3. 预防预防n种子带菌的防治种子带菌的防治 n灭菌彻底灭菌彻底n接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠靠n保藏可靠保藏可靠n过滤空气带菌的防治过滤空气带菌的防治n设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 “死角死角” n发酵罐的发酵罐的“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装