离子交换分离纯化蛋白原理总结(共3页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上离子交换分离纯化蛋白原理及应用离子交换剂基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶（HPLC）等离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 根据交换基团的电荷性质进行分类：阳离子交换树脂： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基阴离子交换

2、树脂： 强碱 含季胺基团 -N+(CH3)3 弱碱 含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。弱酸型只能在碱性pH范围内使用 弱碱型只能在酸性pH范围内使用离子交换纤维素的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素 DEAE-纤维素,具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素CM-纤维素,具有羧甲基，分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细

3、、比重大，能制成紧密的柱，交换容量大，分辨率高。离子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点，分离大分子物质，不会引起被分离物质的变性戒失活，非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的3-4 倍)；容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH 的变化，床体积变化大，明显影响流速;另外,由于它的凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）平衡缓冲液：它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换

4、剂有适当的结合。增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。强酸性阳离子换剂H+的结合力比对Na+的小；H型SP Sepharose FF Nacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱 磷酸缓冲液平衡弱酸性阳离子交换剂对H+的结合力远比

5、对Na+的大；Na型 CM-纤维素NAOH或HCL H+或Na+洗脱强碱性阴离子交换剂对OH- 的结合力比对C1-的小得多；OH型弱碱性阴离子交换剂对OH- 的结合力比对Cl- 的大。 Cl型DEAE-纤维素Nacl、NaOH、乙酸铵（NH4Ac）、磷酸根（PO3-）洗脱 Tris-Hcl、磷酸盐缓冲液平衡。阴离子交换剂碱性 碱性缓冲液 酸性蛋白 蛋白pI pH 时 带负电阳离子交换剂碱性 酸性缓冲液 碱性蛋白 pI pH 时 带正电DEAE-纤维 阴离子交换剂纯化分离酸性蛋白 碱性缓冲液 CM纤维素 阳离子交换剂纯化分离碱性蛋白 酸性缓冲液 碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附 蛋白在pH5

6、8稳定时，则应选择阴离子交换剂；蛋白在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。阴离子交换剂，pH8.6以下分离中性或酸性物质。阳离子交换剂，一般pH>4条件下使用，DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为79，然后提高盐浓度或降低pH使之洗脱。CM纤维素常选在pH4.56.0左右吸附蛋白质，然后提高pH或盐浓度进行洗脱。 例：用离子交换，那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子，还有就是你的目的物的PH值蛋白质是pI=6.27 阴离子交换，用pH8.0-9.0的缓冲液 首先利用缓冲液PH值把目的蛋白给结合到柱子上，然后用合适的盐离子洗脱下来。阴离子交换柱：上样缓冲液20mM Tris-HCl，用00.5M NaCl梯度洗脱，流速约2ml/min。注意：首先是蛋白的等电点是多少选择pH值，挂柱时pH尽量不要超过pI值的2个点。Nacl的浓度可以设梯度，平衡时用0.1mol之后可以选择0.3 0.6 1.2m