早孕因子的生物学机制及其作用

1、早孕因子的生物学机制及其作用         10-04-21 14:23:00     编辑：studa20                         作者：修晓娜 ，史远刚，关伟军，马月辉【关键词】  早孕因子

2、    早孕因子（early pregnancy factor,EPF）是存在于妊娠早期母体血清中的一种免疫抑制因子，被认为是热休克蛋白家族成员伴侣蛋白10（Cpn10）的同系物，在细胞外发挥效应，具有免疫抑制和生长因子的作用，嗣后发现它还对损伤修复过程及一些恶性肿瘤的生长起到支持作用。可用玫瑰花环抑制试验（RIT）做生物学鉴定。但由于其检测方法RIT的复杂性及检测效率低等问题，EPF的应用受到了极大限制。近年随着单克隆抗体（McAb）技术的不断进展，EPF的检验不仅可作为人类及家畜超早期妊娠诊断的指标，而且对预测流产和早期胚胎死亡，迅速鉴定胚胎移植效果以及尽早评

3、价公畜的繁殖能力都有重要意义。并且EPF对于预测早期胚胎发育情况，帮助了解妊娠母体对胚胎的识别、免疫耐受和受精检测等机制提供了可能。我们希望能够制备出EPF特异性McAb，用于超早孕诊断，以及流产和某些恶性肿瘤的早期诊断及预后判断。    1早孕因子的来源长期以来，人们对EPF的来源及结构做了多方面的研究，认为有一种卵因子在受精后开始诱导产生EPF。Lash等1在不同体外条件如:胚胎培养基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮质颗粒释放培养基（CGRM）下刺激动情期小鼠的卵巢及输卵管以观察是否有EPF的产生，并用RIT检测，结果发现三种情况均可检测到EPF活性，

4、该作用可完全被BN52021（一种PAF拮抗剂）阻断，认为PAF即系这种由受精卵释放的促使EPF合成起始的卵因子。他们还发现，卵巢对上述三种刺激均有反应，而输卵管则无，表明了卵巢是产生EPF的最初场所。EPF的产生具有两个阶段也是人们所共同支持的观点，第一阶段为着床前期，为了确定第二阶段是在着床时还是在囊胚期，Lash等2利用红鹿受精卵在输卵管内转运时间较长这一特性，通过监测其血清内EPF活性变化，证实EPF的合成与囊胚形成密切相关。Ito等3对胎牛、小牛、动情期牛及妊娠期牛血清与体外受精的牛卵细胞进行共培养，用RIT检测EPF活性，结果显示EPF活性来源于受精卵细胞。Aranha等4以35S

5、-蛋氨酸标记从孕母体内获取的淋巴细胞并培养使其增生，发现在妊娠期间淋巴细胞内蛋白合成增加，经检测发现其中一种具有EPF活性的分子。实验组35S-蛋氨酸在淋巴细胞中含量明显高于对照组，且在妊娠前两个阶段呈逐渐增高的趋势，在妊娠晚期降到接近对照组的水平。表明EPF有可能来源于孕妇外周血的淋巴细胞。有学者利用类固醇激素诱导培养动情期小鼠卵巢及输卵管检测是否有EPF合成，以探知卵巢激素对EPF合成的重要意义。发现在17-雌二醇、孕激素及睾酮存在条件下对动情期小鼠卵巢及输卵管进行培养，无EPF合成，而在ECM及PAF条件下培养经17-雌二醇、孕激素二者预处理的相同组织则可检测到EPF活性，证实EPF的合

6、成起始主要依赖于一个合适的激素环境5。    2早孕因子分泌机制和作用机制    2.1分泌机制关于EPF的分泌机制已报道了几种假设，其中以Lash等及Orozco等的研究最为权威。Lash等6在不同体外条件如胚胎培养基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮质颗粒释放培养基（CGRM）下刺激动情期小鼠的卵巢及输卵管时，结果发现三种情况均可检测到EPF活性，该作用可完全被BN52021（一种PAF 拮抗剂） 阻断，认为PAF即是这种由受精卵释放的促使EPF合成起始的“卵因子”。他们还发现，卵巢对上述三种刺激均有反应，而输卵管则无，表明

7、了卵巢是产生EPF的最初场所。Orozco等7给成年雌鼠注射合成的PAF，1 h内动物血清表现出EPF活性，推测源于胚胎的PAF可能就是触发着床前产生血清EPF的动因。而在ECM及PAF条件下培养经17-雌二醇、孕激素二者预处理的相同组织，可检测到EPF活性，证实EPF的合成起始主要依赖于一个合适的激素环境。妊娠时产生的EPF的来源不同，早期EPF（母体EPF）系在植入（pre-implantation） 及围植入（peri-implantation）时产生，而晚期（胎儿性EPF）则自围植入期开始一直持续至妊娠中期，但对附植前血清EPF的体内来源说法不一，而普遍认为EPF的产生与卵巢、输卵管、

8、受精卵、胎盘、垂体等有关。    2.2作用机制在EPF作用机制的研究中，科学家们也做出了许多成绩。EPF通过至少两种淋巴因子EPF-S1和EPF-S2的调节发挥作用，前者是受主要组织相容性复合物（MHC）限制的，后者不受MHC的限制，并且已经分离纯化出EPF-S1的类似物，具有生物活性，EPF-S1可诱导产生EPF-S2。现在普遍认为EPF是热休克蛋白家族成员伴侣蛋白10（Cpn10）的同系物，但Somodevilla Torres等8证实Cpn10和EPF在作用机制上有区别。在Lewis鼠的皮肤移植实验中，在移植部位注射rEPF后，能延长皮肤的存活时间，表明E

9、PF具有免疫抑制的调节作用，抑制了机体的免疫排斥作用9。Zhang等用rEPF处理患有脑脊髓炎（exper imental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠，进行分析检测，发现EPF抑制了细胞调节的免疫反应，并可减少中枢神经系统的淋巴细胞和巨噬细胞，提出EPF可呈剂量依赖性地抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的识别相，EPF也可诱导非黏附性的Thy12+ 、Lyt- 、Lyt2+调节细胞（即抑制细胞），EPF的免疫效应不受MHC所限制，小鼠在胚胎植入前给予抗EPF抗体，可减少植入数，提示EPF在生殖过程的这一阶段具有重要意义。EPF有调节CD4+T细胞依赖的

10、免疫反应作用10，11，抗CD4+能抑制绵羊红细胞和其在T细胞上受体的相互作用，EPF是通过抗CD4+来发挥其抑制作用的。在小鼠实验中表明它具有抑制迟发型过敏反应，并发现它会对一些淋巴细胞有约束作用，推测它通过约束CD4+T细胞来发挥作用。经分离T细胞和单核细胞，并用EPF标记，发现EPF会约束CD4+、CD8+、CD14+和CD56+NK细胞，但是EPF作用的细胞表面分子仍没有研究清楚。    3早孕因子的生物学作用    3.1在生长调节中的作用在发现肿瘤细胞也可产生EPF后，人们就推测EPF可能与细胞分裂有关，有促进细胞生长的功

11、能。有以下几方面的研究结果来验证这一观点:（1）在体外培养肿瘤细胞系，发现肿瘤细胞可分泌EPF，并与细胞生长时相有关，细胞停止增殖，进入分化阶段时，产生的EPF明显减少。当肿瘤细胞与不同浓度的EPF单克隆抗体共同培养时，细胞的存活率随抗体浓度增加而降低。同一研究还证实了EPF可与淋巴细胞相互作用，激活免疫抑制因子，抑制免疫。因此肿瘤的发生可能是EPF免疫抑制和生长调节活性共同作用的结果。（2）在维持胚胎活性中的作用。Athanasas Platsis等12通过小鼠体内实验发现，在受精后第3天，使用EPF抗体的所有小鼠中，体内的胚胎没发生同样情况。近期，同一研究小组还发现在胚胎植入前期对母鼠使E

12、PF抗体可导致植入失败，且胚泡滋养层细胞生长明显受到抑制13。（3）1994年Ouinn等14在小鼠进行肝脏部分切除术8 h后的血清中检测到EPF，术后48 h达到高峰。如果术后18 h用抗体主动免疫小鼠，结果残余肝脏对3H胸苷的摄取量明显下降，说明在肝细胞增生期间，EPF对DNA合成和细胞分裂很重要。这些证据提示，EPF可能是通过自分泌或旁分泌方式产生的一种生长因子，并且参与正常细胞的增殖过程。然而有关其发挥调节生长功能机制的研究还未见报道。    3.2在生殖免疫学中的意义邓松华等15为探讨EPF活性物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及其在胎母免疫中的作用，用淋巴细

13、胞转化法观察EPF对后者的作用，结果发现它能抑制淋巴细胞DNA合成，即抑制它的增殖，并呈一定剂量依赖性。根据近年来的文献报道，其作用机制主要有以下几方面:（1）EPF直接抑制淋巴细胞DNA的合成。（2）EPF结合在淋巴细胞上，刺激它产生可溶性抑制因子。其中的两种已被初步认识，分别命名为EPF-S1T和EPF-S2。（3）EPF可抑制某些细胞因子的产生。IL-2主要由CD4+和CD8+细胞产生，可促进淋巴细胞的增殖与分化，是机体免疫网络中重要的细胞因子，因此IL-2的检测已成为评价机体免疫功能状态的指标之一9。体外实验，EPF能抑制IL-2产生，且抗胸腺细胞球蛋白（ATG）能增强这种抑制作用。I

14、L-2活性水平的降低可能参与EPF对淋巴细胞增殖的抑制作用16。（4）黏附分子的表达下降。2000年，Zhang等17用rEPF治疗Lewis小鼠的多发性硬化症的动物模型（EAE），可缓解其临床症状。随后的研究发现，用rEPF治疗与用Vehicle治疗相比，脊髓实质中CD4+与CD8+细胞滴度降低;用rEPF治疗后，中枢神经系统中的白细胞相关功能抗原-1（LFA-1），血管黏附分子-4（VLT-4）和型补体受体（Mac-1）以及免疫球蛋白超家族中的粘连分子细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）都受到抑制。这些黏附分子的减少使T细胞激活失去了必要的协同刺激信号，影响了淋

15、巴细胞的增殖。Igarashi18对早孕因子对生殖免疫的作用总结为: （1）EPF可剂量依赖性地抑制混合淋巴细胞反应（MLR）的识别相。（2）EPF可诱导非黏附性的Thy12+ 、Lyt-、Lyt2+调节细胞，即抑制细胞。（3）EPF的免疫效应不受主要组织相容性复合物（MHC）所限制。（4）小鼠在胚胎植入前给予抗EPF抗体，可减少植入数，提示EPF在生殖过程的这一阶段具有重要意义。    3.3作为肿瘤鉴别Mehta等19报道患滋养细胞肿瘤的孕妇血清中可检出EPF样活性物质，进一步发现仅在绒毛膜癌患者血清中可检测出，而葡萄胎患者血清中却未测出，提示检测EPF有助于

16、鉴别葡萄胎及绒癌。Rolfe等20报道睾丸生殖细胞肿瘤患者血清中可测出EPF或EPF样活性物（tEPF），而健康男性对照者均未测出。由此看来，EPF并非孕妇特有，即某些生殖细胞肿瘤患者血清中亦存在。    4早孕因子的检测与分离    4.1检测EPF的检出是用抗淋巴球血清（ALS）的RIT，其含量用RIT值的高低来衡量。    4.1.1原理在补体存在下，淋巴细胞可与异源红细胞形成玫瑰花环。而ALS能够抑制花环的形成。当加入ALS后花环的形成数是未加ALS的75时，ALS的最高稀释倍数的倒数×

17、10-8取以2为底的对数所得值即RIT。EPF能抑制玫瑰花环的形成，故被检样品中含有EPF就能减少ALS的量而形成同样多的花环，即RIT增高。EPF含量越多，RIT值也越高。一般，RIT>12者为EPF阳性，RIT<12者为EPF阴性。依此原理可以检测孕畜和未孕畜血清或组织中的EPF。    4.1.2玫瑰花环抑制试验的可靠性在用花环抑制试验检测EPF时，只有T细胞的某一亚群预先不经处理，添加红细胞后立即形成的自然花环（Ea花环）才有意义。但这一亚群淋巴细胞占T细胞总数较低，猪中约为10。虽然用物理或化学的方法可以提高花环形成率，但经处理的淋巴细胞在检

18、测EPF时没有意义。许多物质，如免疫抑制药物、精浆、HCG、甲胎蛋白和巨球蛋白等均能抑制自然花环的形成。此外，能破坏淋巴细胞形态和代谢完整性的制剂如神经氨酸盐、三氢化合物、肝素、去污剂等，甚至在有Ca2+、Mg2+等无机离子存在时，都能影响此测定系统的准确性。Koch等（1985）对以前测定EPF的方法稍加改进测定猪的EPF，假阳性率为8.9，假阴性率为12.5。Morton等采集怀孕1个月的绵羊40个样品，只有来自同一只羊的两个样品EPF呈假阴性，而未孕羊的所有样品RIT值都在未孕范围内。一般说来，花环抑制试验分析未孕血清比怀孕血清更为可靠。测未孕血清时重复性较好，批内变异系数为6.8，而测怀孕血清时重复性较差，批内变异系数为23.8。在用花抑制试验测定EPF时，用单克隆抗体替代ALS有望对此法做