痰涂片检查结核分枝杆菌规范化操作及改良安全抗酸染色法介绍

1、痰涂片检查结核分枝杆菌规范化操作及改良安全抗酸染色法介绍塞堕皇塞V01.272009No.23痰涂片检查结核分枝杆菌规范化操作及改良安全抗酸染色法介绍王怡云(甘肃省肿瘤医院,甘肃兰州730050)关键词:结核病;痰涂片;结核分枝杆菌;抗酸染色法中图分类号:tl52文献标识码:B文章编号:16711246(20o9)23-011002结核病实验室检查是发现传染源的主要途径和手段,是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据,也是考核疗效,评价治疗效果的可靠标准.以显微镜检查痰涂片为主发现涂阳病人是世界卫生组织最近推行的现代结核病控制策略(DOTS)中的五大要素之一.并且痰涂片镜检和培养也是全球公认的诊断

2、结核病的基本和标准方法.50多年来,我国一直沿用并不断改进结核分枝杆菌的细菌学涂片,细菌培养,药敏实验和菌型鉴定方法,自1998年以后,逐步与世界卫生组织在全球推荐的方法学相统一,使我国的结核病诊断结果做到了与国际接轨.近年来,我国结核病防治机构的细菌学实验室在结核病诊断的标准化和规范化方面做了大量改进,制定了诊断技术标准,形成结核病质量控制管理系统,促进了结核病诊断水平的不断提高.目前,我国部分结核病实验室已经在细菌学检测的基础上,逐步引进免疫学和分子生物学检测技术对结核病采取多种诊断技术的联合检测.如细菌学,免疫学和分子生物学等检测方法的联合应用,将单一的细菌学检测的灵敏度由原来的30%一

3、50%提高到70%90%,大大提高了结核菌的阳性检出率.虽然免疫学和分子生物学检测技术在诊断灵敏度和检测速度等方面比经典的方法有了很大改进,但与此同时也存在检测成本提高,操作程序复杂,技术要求高等问题,难以标准化,规范化,并且检测特异性及结果解释等方面还需要进一步考核和验证.因此,本文将痰标本涂片,染色,显微镜检查结核分枝杆菌常用诊断方法,规范化操作,镜检结果报告标准,废弃标本和污染物的处理进行归纳总结,同时为了保证操作人员的生物安全,使实验操作流程符合病原微生物实验室生物安全管理条例的要求,将痰涂片抗酸染色方法进行了改进,现介绍如下.1痰涂片检查法l玻片必须是用95%乙醇处理(脱脂,干燥,清

4、洁,无油渍)过的,无划痕的新玻片.一张玻片只能涂抹一份痰标本,只能使用一次,清洗后不得再次用于涂片检查抗酸分枝杆菌.1.1直接涂片法在玻片背面靠左端的1,3处用记号笔编号,用专用竹签折断的毛茬端挑取痰标本干酪样或脓性黏液部分约0.050.10ml,一l】0一于玻片正面的靠右端2/3处中央均匀涂抹成10mmX20mm卵圆形痰膜,待自然干燥后,以1m的距离在紫外线灯下照射,至少照射30min,以杀死痰标本中的病原菌或根据痰涂片的薄厚,适当延长照射时间至1h.然后微火焰固定,抗酸染色或荧光染色后镜检.注意整个痰涂片的制备,固定过程应在生物安全柜中进行,以免污染工作环境,对操作人员造成生物危害.1.2

5、集菌涂片法集菌涂片法包括漂浮集菌法和沉淀集菌法.1.2.1漂浮集菌法取晨起深咳痰或收集24h的痰液,经121,15rain高压灭菌,待冷却后,取约20ml左右于体积为lO0ml,口径约2cm的玻璃容器中,加入灭菌蒸馏水约30mI左右,二甲苯0.30ml,拧紧瓶盖后置振荡器上振荡10rain,然后加蒸馏水至瓶口,将已编号的洁净载玻片的正面扣于瓶口上,静置20min,取下载玻片,自然干燥,火焰固定,染色镜检.1.2.2沉淀集菌法取晨起深咳痰或收集24h的痰液,经121,15min高压灭菌,待冷却后,取5-10ml盛于体积为100ml的离心管中,加水至50ml,经60008000Win的速度离心20

6、rain后,取沉淀物涂片,染色镜检.2萋一尼(zN)抗酸染色法(经典法)D】2.1桀色液染色液:0.8%石碳酸复红溶液;脱色液:3%盐酸乙醇溶液;复染液:0.1%亚甲蓝溶液.2.2染色步骤(1)按上述直接涂片法或集菌涂片法步骤的要求制作,固定涂片.(2)滴加复红染色液布满痰膜,小心加热,出现蒸汽后脱离火焰,保持染色5rain(染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖,可续加染色液.注意加热时切勿使染色液沸腾).(3)让细流水自玻片左侧的1/3处轻轻冲洗(玻片稍倾斜),洗去染色液,沥干剩余水分.(4)自痰膜上端外缘滴加脱色液,布满痰膜,脱色至痰膜无红色为止.(5)重复步骤(3),洗去脱色液,沥干剩余水

7、分.(6)滴加亚甲蓝复染液,布满痰膜,复染色30s.(7)重复步骤(3),洗去复染液,沥干剩余水分.(8)待涂片自然干燥后镜检.2.3镜检与报告(1)用双目光学显微镜(目镜10X,油镜100X)镜检,在亮蓝色背景下,抗酸分枝杆菌呈红色,其他细菌和细胞呈蓝色.(2)萋一尼(zN)抗酸染色法或荧光染色显微镜(目镜10×,油镜100×)镜检结果分级报告标准如下:抗酸分枝杆菌阴性(一):连续观察300个不同视野,未发现抗酸杆菌;抗酸分枝杆菌菌数(±):1-2条/300视野(镜检300个视野找封抗酸分枝杆菌12条);抗酸分枝杆菌阳性(1+):3-9条/100视野(镜检100

8、个视野找到抗酸分枝杆菌3-9条);抗酸分枝杆菌阳性(2+):1-9条/10视野(镜检l0个视野找到抗酸分枝杆菌19条);抗酸分枝杆菌阳性(3+):19条/每视野(镜检每个视野找到抗酸分枝杆菌19条);抗酸分枝杆菌阳性(4+):10条,每视野(镜检每个视野找到抗酸分枝杆菌1O条以上).注意在痰涂片检查结果报告中应包括痰标本的性状和质量.(3)荧光染色镜检结果分级报/.4-怀-准(目镜10×,物镜40×)如下:抗酸分枝杆菌阴性(一):连续观察5O个不同视野,未发现抗酸分枝杆菌;抗酸分枝杆菌阳性(报告抗酸菌数):19条/50视野;抗酸分枝杆菌阳性(1+):1099条/50视野;抗

9、酸分枝杆菌阳性(2+):19条,每视野;抗酸分枝杆菌阳性(3+):1099条,每视野;抗酸分枝杆菌阳性(4+):100条/每视野.3废弃标本和污染物的处理删(1)废弃标本盒及其他污染物,均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗,严禁未经灭菌随意处理废弃标本及其他污染物.痰标本盒等污染物可采用焚烧处理,但须置于焚烧炉内彻底焚化.(2)可将痰标本置于一搪瓷盘中,在生物安全柜中进行痰涂片操作.操作完毕将搪瓷盘与痰标本盒等废弃物一并进行高压蒸汽灭菌.(3)操作台面以3%石碳酸等消毒液擦拭后,再用紫外线灯以lm的距离照射30rain.4改良安全抗酸染色法本文所推荐的改良安全抗酸染色法是在经典萋一尼(zN)抗酸

10、染色法的基础上,一是将3%盐酸乙醇脱色液用5%盐酸乙醇来替代,可获得更满意的染色效果;二是将其加热方法进行改良,以便实验操作流程符合病原微生物实验室生物安全管理条例的要求.现将染色液及操作步骤介绍如下.4.1染色液染色液:0.8%石碳酸复红溶液;脱色液:5%盐酸乙醇溶液;复染液:0.1%亚甲蓝溶液.4.2染色步骤(1)首先于5612电热恒温箱底层放一个大小适宜,并盛有自来水的搪瓷盘;(2)按上述直接涂片法或集菌涂片法步骤的要求制作,固定涂片;(3)将固定好的涂片放置于90rflm一次性无菌平皿中;(4)自痰膜外缘滴加石碳酸复红溶液布满痰膜后,小心将平皿(切勿倾斜)移到56电热恒温箱保温4min

11、;(5)取出涂片,让细流水自玻片左侧的1/3处轻轻冲洗,洗去染色液,沥干剩余水分;(6)自痰膜外缘滴加蝴乙醇脱色液,布满痰膜脱色3min,至无红色为止;(7)it细流水自玻片左侧的1/3处轻轻冲洗,洗去脱色液,沥干剩余水分;(8)滴加亚甲蓝复染液布满痰膜,复染30s;(9)重复步骤(7),洗去复染液,沥干剩余水分;(1o)待涂片自然干燥或冷风吹干镜检.4.3改良安全抗酸染色法的优点(1)实验操作流程符合病原微生物实验室生物安全管理条例的要求.克服了萋一尼(z-N)抗酸染色法火焰加热时产生气溶胶对环境的污染,对操作人员的生物危害.(2)阳性符合率高.我们将萋一尼(z-N)抗酸染色法已确诊的阳性标

12、本(痰液58份,胸水l9份,脓液13份,关节液7份)共97份,采用改良安全抗酸染色法进行对比实验,结果阳性符合率为100%.(3)简便,快速,省时(JJn热只需在56%保温4rain),无需特殊设备,一般实验室均可开展.(4)节约试剂,清洁卫生.克服了萋一尼(zN)抗酸染色法不断加热,不断蒸发的缺点.为了保持痰膜在加热过程中始终被染液覆盖而不干涸,需要不断续加染液,常发生染液溢出,污染操作人员的手与衣物,水池及到处可见被洒落的染液,染液污染既不易清洁,又浪费染液.采用改良安全抗酸染色法只需少量石碳酸复红溶液布满痰膜即可,不仅节约了染液,而且减少了污染.(5)节省人力资源,提高工作效率.克服了萋一尼(zN)抗酸染色法每人每小时最多只能染6张涂片的低工作效率.采用改良安全抗酸染色法,借助一台电热恒温箱(rrd.BU.42一BSII型两层隔板),一个40era×60era的搪瓷盘,每人每小时至少可染20张涂片(2种方法均除去涂片制作及固定时间).(6)操作技术易掌握,染色效果满意.萋一尼(zN)抗酸熟色法加热过程不易掌握,尤其是缺乏工作经验的初学者,稍不慎即可发生涂片干涸,造成脱色困难.反复脱色不仅浪费脱色液,耗时,而且染色效果不佳,影响结果判断.改良安全抗酸染色法克服了上述诸多缺点,操作简便,容易