第五章酶分子的化学修饰：

1、第五章 酶分子的化学修饰：自然界本身就存在着酶分子改造修饰过程,如酶原激活、可逆共价调节等。非共价修饰：添加剂；甘油、多糖、聚乙二醇等多羟基化合物表面活性剂，牛乳过氧化物酶活力在3-4天完全丧失，添加表面活性剂B2，维持获利10天上；蛋白质间的非共价连接-淀粉酶70半衰期5民，抗体保护，16h.从广义上说，凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。50年代，化学修饰用于研究蛋白质结构和功能的关系。为了考察蛋白

2、质中氨基酸残基的各种不同状态和确定哪些残基处于活性部位并为蛋白质的特定功能所必需。20世纪70年代末以来,有关用合成高分子如聚乙二醇()及其衍生物进行蛋白质化学修饰，目的是用于生物医学和生物技术方面。意义：1 基础酶学的研究；活性部位的研究氨基酸顺序分析中，胰酶对精氨酸和赖氨酸具有高度特异性,故常用此酶水解蛋白质,以制备肽碎片.为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题,可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸,使水解局限在其中一个残基的肽键上；测定酶分子中某种氨基酸的数量。探索酶的作用机理和催化反应历程2 提高生物活性(包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变)；3 增强在不良环境中的稳定性；4 针对

3、特异性反应降低生物识别能力解除免疫原性；5 产生新的催化能力。第一节酶分子的修饰方法一、酶的表面修饰（一）小分子修饰：利用小分子化合物对酶的侧链基团进行化学反应在蛋白质结构与稳定性的关系的研究中发现蛋白质结构对稳定性而言并非最合适的，蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸组成,蛋白球体的非极性表面原子簇与水接触不利于酶的稳定.因此,利用小分子化合物使蛋白球表面亲水化以提高酶的稳定性。酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基等乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等酶分子表面的亲水化提高稳定性。广泛应用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖

4、、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亚胺酯等第一个用化学修饰稳定酶的成功实验是在50年代用小分子修饰的。-胰凝乳蛋白酶表面的氨基用乙醛酸修饰成亲水性更强的一NHCH2COOH后，稳定性在60可提高1000倍。马肝醇脱氢酶的赖氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同时酶稳定性也提高许多，底物专一性也有所改变。稳定性及一定催化特性的改变。（二）大分子修饰 可溶性大分子，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、肝素等。PEG类修饰剂应用最广，具两亲性、无免疫原性和毒性。多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG）PEG修饰的L-天冬酰胺酶免

5、疫原性显著降低、半衰期延长。1三氯均嗪法2.N-羟基琥珀酰亚胺法右旋糖苷修饰-淀粉酶：60,t1/2：3.5min；修饰后：175天然过氧化氢酶在6h内很快从血液中出去，PEG修饰后，酶活力在血液循环中可保持72hMPEG修饰过氧化氢酶，有机溶液中的溶解性和酶活提高，三氯乙烷中酶活是原来的200倍，水溶液中为原来的15-20倍。稳定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性与抗原性降低、延长半衰期。（三）交联修饰使用双功能或多功能试剂如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。枯草杆菌蛋白酶交联酶晶体，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交联青霉素G酰化酶，55下的半衰期

6、提高9倍。可使酶分子活性结构加固井可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。（四）固定化修饰二、酶分子的内部修饰（一） 非催化活性基团的修饰改变酶的动力学特征、改变酶对特殊底物的束缚能力。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亚砜，该酶对含芳香族或大体积脂肪族的专一性底物的Km提高2-3倍。（二） 蛋白质主链的修饰猪胰岛素B链的丙氨酸天冬氨酸有限水解切去10个氨基酸后，酶活提高5.5倍类蛋白的合成蛋白分解产物(小肽或低分子蛋白)可以在一定条件下重新组合生成类蛋白。1 水解反应能改进热变性蛋白质的溶解性,也有助于分解和除去杂质，除臭，脱色，提高风味。2 改善氨基酸组成；提高营养价值。导入蛋白质中

7、缺乏的某些必须氨基酸。3 提高蛋白食品的功能性质。凝胶性，起泡性，乳化性、稳定性等。（三） 催化活性基团的修饰蛋白质工程化学突变：将一种氨基酸侧链化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法。枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser转化为半胱氨酸，对肽或酯无水解能力但保留或酯水解能力。转化为硒代半胱氨酸。酰基转移酶及氧化还原酶的活力。（四） 肽链伸展后的修饰脲及盐酸胍处理，酶处于肽链充分伸展，提供了化学修饰内部基团的可能性。修饰后，适当条件下，重新折叠。（五） 与辅因子相关的修饰1依赖辅助因子的酶 辅因子共价结合在酶上NAD共价结合到醇脱氢酶，活力为原来的40%,但解决了辅因子循环利用的问题。 引入新的或修饰过

8、的具有强反应的辅因子许多酶含有辅酶或辅基，是酶的活性基团。由于种类有限，限制了酶的功能。修饰辅因子，可创造出多种多样的新酶。1988年Kaiser将黄素共结合在木瓜蛋白酶上,从而将蛋白酶转变成氧化原酶。2.金属酶中的金属取代酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。用钴取代羧肽酶活性必需的锌，结果肽酶活性和酯酶活性都升高；但如用锰或镉取代锌时，其肽酶活性升高，酯酶活性却下降。酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钻取代时，酶的底物专一性和最适pH都有改变。锌酶对N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH为8.5，钴酶7.0。钴酶对另外三种底物的活力降低。5定点突变与化学修饰结合法第二节 酶蛋白侧链

9、的小分子修饰一、巯基的化学修饰巯基在维持亚基间的相互作用和酶催化过程中起着重要作用。是最容易反应的侧链基团。因此开发了许多修饰巯基的特异性修饰剂。烷基化试剂和其它一些卤代酸和卤代酰氨是重要的巯基修饰试剂. 烷基化试剂：一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺、巯基乙醇。其他卤代乙酸用来修饰巯基。但也会和咪唑基结合。 有机汞试剂：对氯汞苯甲酸(pCMB)或（PMB）专一性最强，修饰产物在250nm处有最大吸收。5，5-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman 试剂)也是最常用的巯基修饰剂，它与琉基反应形成二硫键，释放出1个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处有

10、最大吸收因此能够通过光吸收的变化跟踪反应程度。定量酶分子中巯基数目最常用的试剂。N乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强的疏基修饰剂，与巯基形成对酸稳定的衍生物反应产物在300 nm处有最大吸收。二、氨基的化学修饰赖氨酸的-NH2反应活性很高，容易被选择性修饰。 氨基的烷基化已经成为一种重要的赖氨酸修饰方法，这些试剂包括有卤代乙酸、芳香卤、芳香族磺酸。碘代乙酸（反应条件的控制）三硝基苯磺酸（TNBS），与赖氨酸残基反应，420nm，367nm能产生特定的光吸收。在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰非常重要。用于多肽链N-末端残基的测定的化学修饰方法最常用的有2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又称san

11、ger试剂)丹磺酞氯(DNS)法，苯异硫氰酸酯(PITC)法。 磷酸毗哆醛(PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰试剂，可逆反应生成的席夫碱可通过硼氢化钠还原来固定，反应可通过325nm处光吸收定量。三、羧基的化学修饰水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基已成为最普通的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。但是在一定条件下，丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反应。一、 咪唑基的化学修饰组氨酸残基位于许多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸DPC在近中性PH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。除组氨酸的咪唑基外，DPC还可能修饰半胱氨酸巯

12、基等。用连四硫酸钠或连四硫酸钾对SH进行可逆地保护。二、 吲哚基的化学修饰色氨酸残基一般位于酶分子内部，而且比巯基和氨基等一些亲核基团的反应性差。N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，通过280 nm处光吸收的减少跟踪反应，但是酪氨酸存在时能与修饰剂反应干扰光吸收的测定2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。但易于巯基作用，修饰时应对巯基进行保护。三、 甲硫基的化学修饰四、 二硫键的化学修饰通常是通过还原的方法。二硫苏糖醇（DTT）巯基乙醇作为二硫键的还原剂五、 酚基的化学修饰四硝基甲烷（TNM），是最常用的酪氨酸残基的修饰剂，在温和条件下可高度专一的酪氨酸酚基。苏氨酸

13、和丝氨酸残基的专一性化学修饰研究得相对比较少，它们的羟基一般都可被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰，只是反应的条件要更严格一些，而一旦反应，生成的产物要比与酚羟基生成的产物更稳定。二异丙基氟磷酸（DFP）对丝氨酸有高度反应性。苯甲基璜酰氯（PMSF）也能与丝氨酸残基作用六、 胍基的化学修饰精氨酸残基含有1个强碱性的胍基，在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起着重要作用。丁二酮、1，2-环己二酮苯乙二醛：反应在碳酸氢盐缓冲液中反应较快，并且，在该条件下与-氨基不反应。4-羟基-3-硝基苯乙二醛（405nm）和对硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性质。并且对硝基苯乙二醛的产物具有旋光性，特别适合于精氨

14、酸的定量。第三节 酶蛋白侧链的大分子修饰一 、PEG简介聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG） HO(CH2CH2O)nH HOCH2CH2OCH2CH2OHn。线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性， 具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有机溶剂; 无毒，免疫原性低 其优异的生物相容性也已经通过美国FDA认证; 分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大; 适合用作修饰剂或修饰剂出发原料的PEG的相对分子质量一般为50020000 可以将它的许多优良性质:如亲水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬细吞噬性等等，赋予修饰后的生物分子。为避

15、免在修饰过程中发生交联和团聚，通常采用单甲氧基聚聚乙二醇(mPEG)作为修饰剂。二、 PEG的活化1.第一代PEG衍生物缺点：反应选择性低，修饰后蛋白药物的抗原性和半衰期改进效果不明显，容易引发蛋白质的交联与团聚，衍生物与药物反应形成的连接键稳定性不高。 蛋白质或肽类分子上的反应性官能团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减:巯基>-氨基>-氨基>基>羧基。蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的-氨基。传统的PEG随机修饰多以赖氨酸的-氨基为修饰目标。在蛋白质类分子表面往往有多个lys残基，当PEG衍生物无选择性的和-氨基反应时，不同

16、个数的PEG同蛋白质的连接物就会有一系列不同的分子量。而且在很多情况下，PEG 的功能基团既能同lys上的氨基反应，又能同his上的氨基和cys上的巯基反应，这样形成的PEG复合物将是一个很复杂的混合物。2.第二代PEG衍生物特异性PEG修饰1，疏基修饰 此类PEG 偶联剂主要有:PEG-马来酰亚胺；PEG -乙烯基砜；PEG -碘乙酰胺；PEG -吡啶-二硫醚；。其中，PEG-马来酰亚胺应用较多。2 , N-末端氨基修饰PEG-醛；mPEG-三氟乙磺酸的修饰通常，蛋白质N 末端氨基pKa(7.6-8.0)小于蛋白质其他的氨基酸，PEG-醛与N PEG-醛与蛋白质上N末端氨基反应先形成席夫碱，

17、再经氰基硼氢化钠还原后可形成比较稳定的亚胺连接体。3、羰基修饰对于N末端为丝氨酸和苏氨酸的蛋白质，用高碘酸钠氧化形成醛基，与PEG -ONH2 偶联剂发生特异性反应生成。 而末端非丝氨酸和苏氨酸的蛋白质， 可以先通过转氨反应生成酮，或者用氨肽酶水解生成丝氨酸或苏氨酸。4.各种结构的PEG枝形PEG使用2个(或PEG-SC)连接到赖氨酸的或-氨基上，形成一个末端而分子量极高的PEG。叉形PEG末端有两个活性基团。一般情况下，相同分子量的枝形PEG比链形PEG修饰的产物有效分子量更大，有效半径也更大，因此枝形PEG修饰的产物对酶降解抵抗性更强，并且能够更好的遮蔽药物的抗原决定簇；由于枝形PEG的空

18、间位阻较大，不太容易进入药物的活性部位，对药物活性的影响相对较小; 由于具有较大的空间位阻，一般枝形PEG的反应活性要低于链形PEG，因此所得修饰产物相对更为均一。第三节 酶化学修饰的基本要求一、被修饰酶的性质1酶的稳定性修饰反应条件的确定。2.酶活性中心的状况哪些氨基酸残基参与了酶的活性中心；是否需要辅助因子、为何种辅助因子。3.酶侧链基团的性质及反应性。用于选择修饰剂。二、修饰剂的选择满足如下要求:一是不引起蛋白质的不可逆变性；二是尽可能提高修饰反应专一性。依据试验的目的：1.综合考虑如下一些问题： 蛋白质的种类和修饰位点； 修饰剂对氨基酸残基的专一性如何； 期望的修饰度是多少； 反应是否

19、需要可逆； 修饰剂的特性：水解稳定性和反应活性,修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、毒性、免疫原性; 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变;修饰后是否需要进一步分离;是否适合于建立快速、方便、准确的分析方法;修饰剂的合成是否简便经济,修饰剂是否价廉易得等。2.修饰剂的要求 较高的选择性； 温和的反应条件； 标记的残基稳定、易通过降解分离，进行鉴定； 反应的程度能用简单的技术测定。如有特殊的光吸收三、反应条件的确定在酶稳定的条件下进行，尽量不破坏酶的活性基团；是有利于选择性地修饰蛋白质。1pH与离子强度pH决定了具有潜在反应能力的功能基所处的可反应和不可反应的离子状态。由于它们的解离状态不同，反应性能

20、也不同。例如：在pH25时，碘乙酸可以选择性地与Met的侧链基团发生修饰反应，而在此pH条件下，可被碘乙酸修饰的基团，如巯基、咪唑基和氨基等，都处于非反应的状态。另一方面，有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形成不同产物。例如：1，2环己二酮在pH89时，与LArg生成N7，N8(1，2二羟基环已1，2烯)LArg；促在pH11时，其产物主要是N(1羟基5氧代2，4二氮杂双环4菲2内翁烯)L鸟氨酸。2.修饰反应的温度和时间 决定了反应的的修饰度 影响反应的专一性严严格控制温度和时间可以减少以至消除些非专性的修饰反应。比如：用聚乳糖作修饰别表面修饰酶(还原剂为氢硼化氰，BH3CN)时在8时1

21、0d内几乎无反应而当温度从25上升到37时反应速度加快了3倍，而且随pH的升高而加快；又如：用甲酸氧化酶蛋白的反应，在低温(约10)下修饰反应仅限于Cys、胱氨酸和Met残基上，而在较高温度下，甲酸可以与Trp、Tyr3酶与修饰剂的比例控制修饰度。四、修饰效果评价 修饰度和均一性的分析测定对修饰反应评价时至少有三个因素必须考虑：第一，有多少修饰剂已经结合到蛋白质上；第二，哪些氨基酸被修饰剂修饰，修饰度是多少；第三，修饰物中有多少种不同形式的修饰剂蛋白质偶合物，每种各有多少。 测定修饰度方法有直接法和间接法。直接法中以光谱法最简单和实用，而且还很容易考察修饰反应动力学。但此法要求修饰蛋白具有特异

22、性光谱或其光谱与修饰剂显著差异，而符合该条件的修饰剂很少。比较容易实现的是间接法。间接法中比较普遍的办法是设法测定已经被修饰的氨基酸的数目。通常采用“TNBS法”(或称Habeeb 法)11,12和荧光胺法13,14，这两种方法已被证明是用来监测作用于氨基酸的修饰剂对蛋白质修饰程度的最为有效的方法。另一种途径是测定已经减少的修饰剂的量，如用两相体系法15、质子NMR16,和14C标记17来检测修饰剂的量。 由于修饰反应的复杂性，要准确测定修饰蛋白的均一性迄今仍然非常困难。质谱、核磁共振、SDS-PAGE等都曾先后被尝试用来分析修饰蛋白的均一性。其中以SDS-PAGE技术应用最为普遍。毛细管电泳是另一种有用的分析方法，现已经越来越多地用于PEG蛋白质偶合物分析。最近的研究报道表明该法可以用于确定修饰蛋白中的每一个修饰基团21,22。此外，毛细管电泳还可以用于分析碎片化的修饰蛋白确定修饰剂的修饰位点。第四节化学修饰对酶性质的影响1 稳定性增强l修饰剂分子存在的多个反应基团，常与酶形成多点连接。酶表面修饰后亲疏水性及电荷的改变，导致稳定性增强2