标记有丝分裂百分率法计算

1、细胞周期测定 -标记有丝分裂百分率法标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂分裂期细胞百分数的办法来测定细胞周期。细胞周期测定，首先待测定的细胞进行同步化。在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中，需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。细胞人工同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法；诱导同步化常用的方法有DNA合成阻断法和

2、中期阻断法。下面简单介绍有丝分裂选择法与DNA合成阻断法。选择同步化主要是有丝分裂选择法，该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放4冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。DNA合成阻断法，选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处；胸腺嘧啶核苷（TDR）双阻断法为最常用的方法：该法利用过量TDR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TDR阻断法，即双阻断法。第1次阻断时间相当于G2、M和G1期时间的总和

3、或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次，再释放。现以HeLa细胞为例加以说明（HeLa细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h）。首先将细胞培养至指数生长期的早期，加入含2 mmol/L TDR的培养基（22.5 mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养），作用16 h。弃掉TDR培养基，用Hanks液洗23次，再换上新鲜培养基继续温浴9 h。重新加入TDR培养基（浓度同上）进行第2次阻断，作用16 h。再弃掉TDR培养

4、基，Hanks液洗23次后换上普通培养基。第2次TDR释放0 h时取样则细胞处于G1/S期交界处；如27 h取样则为不同阶段的S期细胞。注意：具体TDR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值，也可根据经验确定。标记有丝分裂分裂期细胞百分数的办法来测定细胞周期，首先取同步化了的不同阶段的S期细胞，利用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TDR）短暂培养该种细胞一段时间后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸腺嘧啶脱氧核苷，再移至普通培养基中培养，换用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。不同间隔时间取样，找出正处于分裂期细胞的百分数。TG1：G1期的持续时间TG2

5、：G2期的持续时间TS：S期的持续时间TM：M期的持续时间TC：一个细胞周期的持续时间PLM：标记的有丝分裂分裂期细胞所占的比例测定原理：细胞周期各阶段的时间与PLM的关系待测细胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞均被标记。S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。开始出现标记M期细胞时，表示最早处于S期最后阶段的细胞（即领先细胞），已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从放射性开始出现M到PLM达到最高点（100%）的时间间隔就是TM。当PLM开始下

6、降时，表明最晚处于S期最初阶段的细胞（即落后细胞）也已进入M期，所以放射性出现PLM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。从PLM出现到下一次PLM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。例1：为测定某种细胞分裂的细胞周期，利用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷短暂培养该种细胞一段时间后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸腺嘧啶脱氧核苷，再移至普通培养基中培养，换用

7、无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。不同间隔时间取样，找出正处于分裂期细胞的百分数。A：处于S期的细胞都被3H标记；B：被标记细胞最早进入分裂期；C：50%分裂期细胞被标记且在增加；D：50%分裂期细胞被标记且在减少；E：出现被标记细胞第二次进入分裂期。下列推测中，说法正确的是A实验开始时细胞核中被标记的物质是DNA，标记的时期是M期BD点时标记细胞比例减少，表明最慢的标记细胞开始进入G2期C该细胞的细胞周期中S期占3小时D分裂期经历时间约为1h【解析】用tG1、tS、tG2、tM表示各时期的时间，Tc表示细胞周期。根据题意可知，在体外采用短暂3H-TdR（胸苷）脉冲标记，然后洗脱标记物，其中

8、3H-TdR（胸苷）只存在于胸腺嘧啶这种碱基中，而胸腺嘧啶是DNA分子中特有的碱基，将用于DNA复制。因此一开始处于S期的细胞均被放射性标记，如有处于G2、M、G1期的细胞均未被标记，可推知标记的时期是S期，A错误；由细胞周期看，经过相当于G2期的一段时间，被标记的细胞最早离开S期开始进入M期，该时间为3小时，即G2=3小时，C错误；S期和M期间隔G2期，因此当M期细胞的50%被标记首次出现时，相当于经历的时间为tG2+1/2tM=3.5小时。当D点时标记的M期细胞减少到50%时且比例减少，表明最慢的标记细胞进入M期一半时间，B错误；D点时标记细胞比例减少，表明最慢的标记细胞进入M期中点，即表

9、示在S期最后一个完成复制的细胞到达M期的一半，该时间相当于经历tS+tG2+1/2tM=10.5小时，当标记的细胞第二次出现在M期时，相当于经历的时间为Tc+tG2=25小时，因此该细胞的一个细胞周期共耗时22小时，S期7小时，分裂期经历时间约为1h，D正确。例2：（浙江省第11届高中生物学竞赛题）在某生物细胞培养液中加入用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，短暂培养一段时间后，洗去3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。使在该段时间内已处于DNA复制期不同阶段的全部细胞中DNA被3H标记，而当时处于其他时期的细胞则不带标记。不同时间取样做细胞放射性自显影，找出正处于有丝分裂的分裂期（M期）细胞，计算其中带3

10、H标记的细胞占有丝分裂细胞的百分数。得到下图（图1图4中横轴为时间，纵轴为带标记细胞占总细胞数的百分数）：（1）图1中a点开始检测到带3H标记分裂期细胞，则oa为期，理由是：。（2）图2中b点带3H标记分裂期细胞数开始达到最大值，则ab段表示期，理由是：。（3）图3中c点时，带标记的细胞百分数开始下降，则ac段所经历的时间相当于期的时间。（4）此后，带标记的分裂期细胞数逐渐减少，直到消失，到第二次出现带有标记的细胞数时为图中e点，则de段所经历的时间相当于时期的时间，因此一个完整的细胞周期的时间相当于段经历的时间。答案：(1)G2原处于DNA复制期最后阶段的细胞，最先进入分裂期最先出现放射性标

11、记，因此，从实验开始到分裂期细胞开始出现放射性物质之间的时间段恰好是G2期的长短。(2)分裂期a点后，原处于DNA复制期最后阶段的细胞完成有丝分裂（a点后，原处于DNA复制期其它阶段的细胞陆续进入分裂期，标记细胞数逐渐上升，达到最高点时，说明原处于DNA复制期最后阶段的细胞已完成有丝分裂，开始进入下一细胞周期的G1期）（3）S（或DNA复制）（4）G1期和G2期ae【解析】一个完整的细胞周期包括间期和分裂期（M期），间期又可划分为G1期（主要进行RNA和有关蛋白质的合成）、S期（进行DNA分子复制）和G2期（继续合成少量的蛋白质和RNA）。使处于DNA复制期不同阶段的全部细胞的DNA被3H标记

12、，而处于其他时期的细胞则不带标记。然后找出正处于有丝分裂的分裂期细胞并计时。a点，首次出现放射性标记，之前这段时间为G2期。理由：处于DNA复制最早完成最后阶段的细胞最先进入分裂期，从而出现带标记的M期细胞，此细胞经过的时间为G2（oa）。a点后，至b点，从最先开始出现放射性标记（0%）到放射性标记达到最高峰（100%），这段时间为M期。理由：后续的部分细胞相继进入了分裂期，到原处于DNA复制期最晚完成最后阶段的细胞完成有丝分裂时，分裂期各时刻都有了细胞，故放射性标记开始达到最高峰（100%）。此细胞经过的时间为G2+M（ob）,故ab=ob-oa=G2+M-G2=M。b到c，放射性标记持续为

13、最高峰（100%），ac段时间为S期。理由：放射性标记开始达到最高峰（100%）时，还有部分后续的细胞没有进入分裂期，故100%的最高峰可以持续一段时间。当原处于DNA复制最晚的最先时期的细胞开始进入分裂期时，最高峰结束，此细胞经过的时间为S+G2（oc），故ac=oc-oa=S+G2-G2=S。c到d,即放射性标记由最高峰（100%）逐渐减少，直至为0。此时，原处于DNA复制最先时期的细胞完成有丝分裂，不再有本周期的细胞带标记。此细胞经过的时间为S+G2+M（od），cd=od-oc=（SG2M）（SG2）M。到e点时，第二周期的细胞开始出现标记，即原处于DNA复制期最早完成最后阶段的细胞再

14、次进入分裂期，经历的时间为一个细胞周期（一个周期的分裂开始到下一周期的分裂开始，即分裂开始到分裂开始，总时间与一个完整周期(即一次分裂结束到下一次分裂结束）相同），即ae。也可运算：oe=G2+M+G1+S+G2，而oa=G2，故ae=oe-oa=（G2+M+G1+S+G2）-G2=G1+G2+S+Mde=ae-ad=G1+G2+S+M-(S+M)=G1+G2例3：不同细胞的细胞周期长短不一。利用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸培养某种细胞一段时间后再移至普通培养基中培养，不同间隔时间取样，进行放射显影，在显微镜下观察计数，统计标记细胞的百分数。A：细胞核开始被标记；B：一个被标记细胞X开始进入分裂期；C：细胞X着丝粒开始分裂；D：细胞X分裂成两个子细胞，被标记细胞数目在增加；E：标记细胞第二次进入分裂期；F：被标记细胞的比例在减少；G：被标记细胞的数目在减少。试回答：（1）该细胞分裂一次平均经历的时间为h。实验开始时细胞核中被标记的物质是，图中期、期（用图中字母表示）DNA分子稳定性最低，适于进行诱发突变。（2）被标记的细胞数目减少的原因是。（3）图乙分裂状态位于图甲的（用图中字母表示）期的前段，细胞内含有个染色体组。（4）皮肤癌细胞的细胞周期（填“大于”、“小于”