黑曲霉产柠檬酸

1、柠檬酸发酵工艺条件的优化 摘要  柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规

2、律基本一致。另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。 1. 课题背景 1.1柠檬酸简介 柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。 柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13） 物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉

3、末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。 化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离； 加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。1.2柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂

4、，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。  1.3柠檬酸循环 又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循环(Krebs cycle)。体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。由克雷布斯（Krebs）于2

5、0世纪30年代最先提出。1.4实验发酵机理 1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。 2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。 3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。1）Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；2）柠檬酸脱氢酶在

6、柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。 1.5发酵方法发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3种方法。固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用通用发酵罐。它的主要部件包括罐

7、体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。 为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过柠檬酸不断变异和选育得到的。菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。    1.6黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素 柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温

8、度、通风量及pH值等条件。一般认为，黑曲霉适合在2830时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为24，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利

9、于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。 尽管经过几十年的研究，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有机

10、物是比较容易控制的因子。但是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子Fe2+ 、Mn2+ 等，他们并不是可以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵的浓度。 资料表明：高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力6，培养基中加Cu2+ ，有利于达到最高柠檬酸产量。柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准备，随后要控制Fe2+&

11、#160;的存在才能开始并大量积累柠檬酸。Johnson等在研究黑曲霉的CO2 固定作用时发现有两个CO2 固定系统，这两个系统需要Mg2+、K + 。也有说几种常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+> Mg2+ >Na+ >K+ ，当然还与离子强度有关。 AMP、无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶(PFK)有活化作用，NH4+还能有效的解除柠檬酸和ATP对其抑制，NH4+的浓度和柠檬酸生产速度有密切关系。发酵过程中加入甲醇能明显提高柠檬酸产量。其可能的机理为：甲醇抑制a一酮戊二

12、酸脱氢酶活力，提高丙酮酸羧化酶的活力，增加柠檬酸穿过细胞膜能力，降低胞内柠檬酸浓度，促进柠檬酸的合成，甲醇还能抑制柠檬酸裂解酶的活力。同时发现，甲醇对细胞有一定毒性影响。据报道，某些氨基酸，B族维生素和生物素也能提高柠檬酸产量，另有多种化合物，如NaF、乙二胺四乙酸钠等，也能增加柠檬酸积累，还有植酸、植酸钠、物理因素能提高柠檬酸产量。3. 工作内容 3.1 实验菌株 黑曲霉柠檬酸生产菌株M228。 3.2 主要仪器 电子天平、生化培养箱、10L机械搅拌式发酵罐、配套设备（空压机、过滤器、蒸汽发生器等）、立式灭菌锅、恒温水浴锅

13、、血球计数板和显微镜、台式高速离心机、碱式滴定装置、离心机、电磁炉。 3.3 种子培养 茄形瓶斜面培养扩大制备孢子。马铃薯培养基，35恒温培养箱培养34天。标准糖液中加入0.5%的硫酸铵，八层纱布封口，121灭菌20min，用无菌移液管吸取25mL无菌水至茄形瓶斜面内，并用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下孢子，摇匀后倒入已冷却好的100mL的种子培养基内，包扎好后摇床35、200r/min培养20h17。3.4 培养条件3.4.1糖化清液  细度为40目以上玉米粉15g与100mL去离子水混合调成浆乳，调节pH为5.5-6.0， 加热并搅拌

14、升温至（65±1），按20U/g原料加入-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持60min，液化15min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色，即糖化完全。四层纱布过滤于250ml三角瓶即得糖化清液。 3.4.2 摇瓶发酵培养  标准糖液100ml，加入硫酸铵后于121灭菌20min，冷却至室温，接种。摇床35、200r/min培养。 3.4.3 实罐发酵培养  玉米粉900g,加入6L去离子水调成浆乳，调节pH为5.5-6.0，加入发酵罐，按20U/g原料加入-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持30

15、-60min，液化20min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色为止。再加入0.5%的硫酸铵。蒸汽实罐灭菌后，火焰法接种，200r/min,35下通空气发酵，罐压控制在表压0.1MPa。通风量控制0-18h:200-400L/h，18h以后：600-800L/h。接种后半小时测总糖一次（取发酵液5mL），并记录PH和通风量。以后每4小时记录PH和通风量，每八小时测残糖和酸度一次（取发酵液10mL，离心取上清），最后一个班次每2小时测1次。3.5 分析方法 3.5.1 残糖测定  菲林热滴定定糖法（空白滴定+样品溶液预滴定+样品溶液正式滴定）。

16、0;3.5.2总糖测定 取5ml发酵液，加50ml水和7.5ml浓硫酸，加热至沸，保持5min，急速冷却。冷后用40% NaOH溶液中和至PH7-8，定容至500ml，取样后以残糖测定方法进行测量。 3.5.3 酸度测定20  取5ml发酵液，离心取上清液，精确吸取4ml，加入100ml锥形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429 molL（5.75gNaOH溶于煮沸过的冷蒸馏水中，定容到1000ml，混匀后标定）进行滴定，滴定至微红色，平行滴定3次，记录平均消耗NaOH的体积。滴定1ml样品液，每消耗1ml0.1429m

17、ol/LNaOH时的溶液为1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）。 3.5.4 PH测定  精确PH试纸、PH计（台式）、发酵罐PH电极。 3.5.5 菌种质量检查 (黑曲霉菌)在发酵液成球形体，散开的菌丝较少，菌细胞短，一头较粗如“鞋底状”，而污染的菌多呈菌丝状生长，一般曲霉菌细胞较长而平滑。取培养液稀释在显微镜下观察，合格的菌丝球应是致密形的，菌球直径不应超过01ram，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀28。 3.5.6菌浓度测定  采用B种血球计数板，计数室体积为0.1mm3.一个计数室为一个大方格，一个大方格

18、分成25个中格，每个中格又分为16个小格，即一个计数室由400个小方格组成。计数时，分别在左上、左下、右上、右下和正中五个中格进行计数，然后计算80个小格中平均每小格上菌细胞数，再计算400个小格即整个计数室中的菌体细胞数。位于中格线上的菌体只记此中格的上方及右方线上的细胞；凡菌体母细胞分裂的子细胞达母细胞大小的一半时，即可作为两个细胞计。计算公式：每毫升发酵液中黑曲霉菌细胞数=（80小格内细胞数/80）*400*104*稀释倍数。将样品稀释50倍后，采用上述方法进行计数，每个样品重复计数3次，取平均值29。 3.5.7 氧浓度测定 通风量的控制及发酵罐氧分压电极

19、测定。 (以下的是在学校图书馆查阅的） 3.1 引言 选育出一株优良的高产菌株只是发酵工作的开始，并不意味着就能得到高产，发酵过程中的发酵参数直接影响该菌株的潜力的发挥。发酵过程中会有较多因素影响柠檬酸发酵产量，在发酵培养基营养成分方面影响较大的有碳源、氮源、(NH4)2SO4 添加量、各种金属离子含量等等。在发酵培养条件中影响较大的有：发酵温度、发酵初始 pH 值、发酵接种量、发酵通风量等等。控制适合菌株发酵的最佳营养条件和最佳发酵条件，对提高柠檬酸发酵产量有重大影响。在大规模工业生产中又以通气、搅拌对发酵影响最为显著。由于上述发酵影响因素对黑曲霉柠檬酸发酵的影响较为显著，所以对这些因素进行

20、具体详细的研究是十分必要的。 为了给黑曲霉柠檬酸发酵创造好的条件，本实验研究了玉米粉凊液发酵的工艺条件。并为黑曲霉柠檬酸补料发酵打下了基础。本实验利用摇瓶发酵在实验室采用单因子实验和正交实验研究了黑曲霉 Wsy-03 的最佳发酵培养基组成（包括碳源，氮源），并对影响黑曲霉柠檬酸发酵的发酵温度、发酵初始 pH 及过程中 pH的控制、发酵接种量进行了研究，利用小型自控发酵罐对发酵溶解氧对黑曲霉柠檬酸发酵的影响形成进行了系统研究，以寻求最优发酵培养基和发酵控制条件，同时柠檬酸的补料发酵的研究提供可靠依据和坚实基础。3.2 实验材料3.2.1 菌种 以柠檬酸主要生产菌株黑曲霉(Aspergillus

21、niger)作为实验菌株。3.2.2 培养基(1) 玉米粉种子培养基：自来水与玉米粉按质量比 4：1 的比例混合，110保温并不断搅拌，并加入 -高温淀粉酶，恒温 20min-30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到 20玉米粉糖化液。将 20玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液。用盐酸调节 pH 到 4.5，250mL 摇瓶加人 50mL的 20玉米粉糖化液，纱布封口，121灭菌 30min，得种子培养基。(2) 玉米粉发酵培养基：将20玉米粉糖化液与过滤后的玉米糖化清液按1：5 比例混合(V/V)。在 500mL 摇瓶中加入 50mL 混合后的培养基，添加 0

22、.3% (NH4)2SO4，调 pH4.5，纱布封口。121灭菌 30min，得发酵培养基。3.2.3 试剂及材料 邻苯二甲酸氢钾 硫酸铜 分析纯 天津化学试剂有限公司盐酸 琼脂 碘化钾 氢氧化钠 分析纯 莱阳化工有限公司次甲基蓝 碘 酚酞 酒石酸钾钠 葡萄糖 耐高温 -淀粉酶 2 万酶活/mL 糖化酶 2 万酶活/mL 玉米粉 土豆 3.2.4 仪器设备10L 全自动发酵罐 瑞士Bioengineering AG 空压机 龙海力霸通用机械有限公司PH 电极；pH2050e panel 瑞士 Bioengineering AG 氧电极；DO4050e panel 瑞士 Bioengineeri

23、ng AG 3.3 实验方法3.3.1 初糖含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 初糖浓度对菌体生长的影响 在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为 10%、14%、18%、20%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵开始后，每隔 6h 分别从各个不同初糖浓度的发酵液中吸取 1ml，进行菌丝体净重测量，记录净重变化。(2) 初糖浓度对柠檬酸产酸的影响 在无菌状态下，分别调整发酵液初始糖浓度为 10%、14%、18%、2

24、0%，24%，在玉米液化清液中添加 17%玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。3.3.2 氮源含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 有机氮源的需求量 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50m

25、L)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分别添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬

26、酸发酵的影响。3.3.2 氮源含量对柠檬酸发酵的影响 (1) 有机氮源的需求量 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度18%，在玉米液化清液中分别添加12%，17%，23%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。(2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，再分别

27、添加 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。3.3.3 温度对柠檬酸发酵的影响 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，按 10%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，分别在 30，33，36，39，42温度下，300r/min

28、进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。3.3.4 接种量对柠檬酸发酵的影响 在无菌状态下，调整发酵液初始糖浓度 18%，在玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，0.3%(NH4)2SO4，pH4.5，分别按 6%，8%，10%，12%，14%的接种量接种发育成熟的种子液(250mL 装液量 50mL)，35±1，300r/min 进行柠檬酸发酵，发酵 72h，每组试验做两个平行试验，测定最后的产酸然后求其平均值，从而确定该因素对柠檬酸发酵的影响。3.3.5 通风量对柠檬酸发酵的影响 采用 10L 全自

29、动通风机械搅拌发酵罐，玉米粉液化清液添加 17%玉米粉液化全液，定容到8L ，添加0.3%的(NH4)2SO4，调节初始pH4.5，转速250300r/min，。通风量 12h 前：0.12VVM；12h-72h：0.15VVM，35±1，培养 72h。从发酵 16h开始每隔 6h 取样，测定发酵液中柠檬酸积累量、还原糖消耗量和 pH 值的变化情况。3.4 测定方法1.柠檬酸测定方法：（粗测法）采用 0.1429mol/L 氢氧化钠溶液滴定。2. 还原糖测定：发酵液稀释后，由斐林试剂直接测定。3. 总糖测定：发酵液经酸水解后，由斐林试剂测糖法测定。4. 氮含量测定：凯氏定氮法。5.

30、pH 值测定：酸度计测定或者是精密 pH 试纸测定。6. 菌丝球大小测定：测微计测定。7. 孢子计数：血球计数板计数法测定8. 菌丝球干重的测定：取出一定量的发酵液，离心机中 3000r/min，离心 30min，用蒸馏水洗两遍后，倒掉清液，在烘箱中烘干后称重，记为菌丝净重。9. pH 值测定：酸度计测定或者是精密 pH 试纸测定。10. 菌丝球大小测定：测微计测定。11. 孢子计数：血球计数板计数法测定12. 菌丝球数量测定：吸取 1mL 生长成熟的种子培养基，进行一定倍数的稀释，在显微镜下进行直接计数13. 糖酸转化率计算公式如下: 糖酸转化率 （% ）= 式中 C最终柠檬酸酸度(g/10

31、0mL)； A发酵液起糖浓度(g/100mL)； B发酵结束糖浓度(g/100mL)；14. 产酸速率计算公式如下：产酸速率（ g/100mlh）= 式中 发酵最高酸度(g/100mL)； 发酵起始酸度(g/100mL)； T总发酵时间(h)。3.5 结果与讨论3.5.1 培养基成分对柠檬酸产量的影响 在柠檬酸发酵过程中，发酵初期黑曲霉会利用培养基中的营养成分，利用碳源提供能量，利用氮源提供自身生长发育所需要的蛋白质和核酸等等。如果提供的营养成分不够就会影响黑曲霉的菌体生长和发育。在发酵后期，为了使黑曲霉能有效的积累柠檬酸，必须为菌体提供限量的营养因子。同时发酵液中的金属离子和各种产酸刺激物和

32、抑制物都会对菌体生长和代谢柠檬酸有较大的影响。3.5.1.1 初糖含量对柠檬酸产量的影响(1) 初糖含量对菌体浓度的影响 不同初糖浓度的发酵培养基对黑曲霉菌丝球的生长发育有不同的影响。黑曲霉菌丝球接种到发酵培养基后还要继续生长，经过一段时间的生长发育，菌丝球的净重会达到一个饱和值，然后才开始发酵产酸。将黑曲霉菌丝球接种到不同糖浓度的发酵培养基中，跟踪菌体净重变化，了解不同初糖浓度的发酵培养基对菌丝球生长的影响，结果见图 3.1。 从图 3.1 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 菌丝球在接种到发酵培养基中以后，菌丝球还会继续生长，经过一段时间会达到一个菌丝球浓度饱和值，这个饱和值在初糖浓度 18%

33、以下的发酵培养基中都相同，不同在于达到这个饱和值所要用的时间。从图 3.1 中可以看出，随着发酵液初糖浓度的提高，黑曲霉 Wsy-03 菌丝球净重达到这个最大值所用的时间会越来越长，即较高的初糖浓度会对菌丝球生长产生抑制作用。同时也证明，从菌丝球生长方面看来，控制 12%的发酵初糖，有利于补料发酵。(2) 初糖对产酸的影响 发酵液初糖浓度的高低将直接影响黒曲霉菌体的生长与发育，影响柠檬酸产率和糖酸转化率。从黑曲霉发酵柠檬酸过程分析，如果发酵液初始糖浓度过高，会对孢子的生长发育有抑制作用，同时由于发酵原料是玉米液化液，所以过高的糖浓度还会使发酵培养基浓度过高，严重影响发酵液溶氧，由于在种子生长初

34、期，孢子发育耗氧量非常大，所以发酵液初始糖浓度过高会严重影响菌丝球成型。但是，如果发酵液初始糖浓度太低，则菌丝球会长的很大，且形状不规则，生长不正常。不同发酵初糖浓度对黑曲霉 Wsy-03 柠檬酸发酵的影响见表 3.1。 从表 3.1 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 在发酵液初糖浓度低于 18%时，糖酸转化率一直保持在 90%以上，且柠檬酸产量随发酵液糖浓度的增加而增加。但是在初糖浓度高于 18%时，如果继续提高发酵液初糖含量，明显可以看出柠檬酸产量开始降低，同时糖酸转化率也开始降低。初糖浓度为 18%时产酸率最高，而且糖酸转化率能达到 90.12%，残糖含量仅为 2.92g/100mL。如果

35、从降低粮耗的角度考虑，批料发酵时选择初糖含量在 18%最为合适，产酸率，糖酸转化率都很高。同时从上表中可以看出黑曲霉 Wsy-03 菌株在初糖浓度为 14%的发酵培养基中，发酵速度快，残糖浓度低只有 0.13g/100mL，碳酸转化率高达 91.29%，有利于流加发酵，缩短发酵时间。所以，本实验采用发酵液初糖浓度 18%研究批量发酵的最优条件，采用初糖浓度 14%发酵培养基研究补料发酵的最优条件。3.5.1.2 氮源对柠檬酸产量的影响 菌体利用发酵液中的氮源是为了合成自身生长发育所需要的各种蛋白质、核酸和各种氨基酸.利用部分无机氮源作为菌体自身生长代谢的调节剂。在菌体的生长过程中，不同菌体利用

36、各种有机氮或无机氮的种类是不同的。但是黑曲霉的生长过程比较粗放，可以利用各种有机氮或无机氮作为其自身氮源。但是氮源的含量对黑曲霉柠檬酸的发酵却有十分重大的影响，如果氮源含量过低，会使发酵液处于营养贫瘠状态，使得菌体不能正常的发育生长，具体表现为菌体不能发育成为较完整的菌丝球，使得发酵产酸很低。但是如果发酵液中氮源含量过高，即发酵液营养过于充足，会使得菌丝球疯长，长的过大，且菌丝体过多，大大增加发酵液的粘稠度，影响发酵液溶氧，从而影响产酸。所以研究发酵液氮源含量对提高柠檬酸发酵产量有重要的意义。(1) 氮源的需求量分别测定总糖含量为 18%的玉米液化清液和玉米液化全液的氮含量，具体结果见表 3.

37、2： 以玉米粉液化滤液为基料进行柠檬酸发酵时，需要补充一定量的氮源，通常调整氮源玉米粉液化全液，有时也用薯干粉或豆饼粉。在生产中调节发酵培养基中不同的氮源含量，发现明显影响发酵产酸量。为此，下面对以玉米粉液化滤液为基料，分别添加不同比例的玉米液化全液，调节不同的氮源含量。不同的氮源量对柠檬酸发酵产酸量的影响见表 3.3。 从表 3.3 可以看出，黑曲霉 Wsy-03 以玉米粉为原料发酵柠檬酸时，蛋白质含量在 0.32%时，即往玉米液化清液中添加 17%的玉米液化全液，柠檬酸产量最高达13.23g/100mL，同时糖酸转化率达 90.87%。发酵液中蛋白质含量在 0.26%时，虽然糖酸转化较高，

38、但是产酸量相对较低，只有 90.65%，同时过高的氮源严重影响了菌丝球的形成。所以本实验采用氮源含量在 0.32%，即添加 17%的玉米液化全液，柠檬酸发酵产量最好。 从图 3.2，3.3，3.4（此二图放大倍数为 250 倍）可以看出，不同的蛋白质含量对黑曲霉 Wys-03 菌丝球生长形态有较大的影响。蛋白质含量较少时，由于菌丝球不能得到充足的养分，使得菌丝球发育不好，菌球过小，且菌丝细长，有的发育过短的菌丝不能缠绕成完整的菌丝球。但是当蛋白质含量较高时，菌丝生长又会过于旺盛，大量的分散菌丝不能形成完整的菌丝球，大大的增加了发酵液的粘稠度。增加发酵液溶氧的困难。再次证明发酵液蛋白质含量在 0

39、.32%时，菌丝球缠绕较为紧密，且形成了外围舒展的菌丝，无大量散落菌丝体分散在发酵液中，较有利于柠檬酸发酵。 (2) (NH4)2SO4 添加量对柠檬酸产量的影响有实验证明在柠檬酸发酵的过程中，发酵培养基中除了添加有机氮源外，同时添加一定量的(NH4)2SO4 对柠檬酸产量有较明显的提高。这是因为在柠檬酸发酵的过程中，特别是在柠檬酸发酵过程的后期，开始添加(NH4)2SO4，铵离子对菌体生长无影响，同时铵离子对柠檬酸积累有调节作用，从 NH4+的代谢调节作用考虑，柠檬酸生产菌黑曲霉的 PFK 酶是糖酵解途径中第一个调节酶，也是决定 EMP途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受柠檬酸和 ATP 的

40、抑制，受 AMP、Pi、NH4+所激活，NH4+不仅能激活 PFK 酶，还能解除柠檬酸、ATP 对它的抑制作用。研究黑曲霉柠檬酸发酵过程发现， NH4+在细胞内胜利浓度范围中浓度的高低与柠檬酸生产率有密切的关系。所以 NH4+在发酵过程中，尤其在产酸阶段不应受限。也有文献报道，在我国过去用树干粉为原料发酵柠檬酸时，添加 0.01%-0.05% (NH4)2SO4，不但可以提高产酸，而且能够缩短柠檬酸的发酵周期。不同 (NH4)2SO4 添加量对以玉米粉为原料柠檬酸发酵产酸量的影响见图 3.5： 从图 3.5 可知，黑曲霉 Wys-03 以玉米粉为原料发酵柠檬酸时，发酵液中(NH)4SO2 的添

41、加量在 0.3%时，产酸量较高，同时发酵残糖含量较低。发酵液中(NH)4SO2 添加量高于或者是低于 0.3%，都会是产酸量有所下降，同时残糖含量有所提高，使得糖酸转化率下降。所以，本实验采用发酵液中添加 0.3%的(NH4)2SO4，以提高产酸3.5.1.3 培养基组份优化 为了确定柠檬酸发酵中各培养基营养组份的最佳条件，以影响柠檬酸发酵过程中的重要因素初始总糖浓度(g/v%)、玉米液化全液添加量(v/v%)和硫酸铵含量(g/100ml)进行三因素三水平的正交试验，最终以发酵液中柠檬酸含量(g/100mL)为指标，确定出最佳实验方案。各因素水平安排见表 3.4。 在无菌条件下，将斜面试管培养

42、成熟的黑曲霉 Wys-03 孢子接入到二级种子培养基中(10%初糖，pH4.5)中，35±1，150r/min 恒温摇床振荡培养 24h，镜检菌丝球发育状况，将二级种子培养液接入发酵液中进行柠檬酸发酵培养。以影响柠檬酸发酵过程中的重要因素：初始总糖浓度(v/v%)、接种量(%)和(NH4)2SO4 含量(g/100ml)进行三因素三水平的正交试验，最终以发酵液中柠檬酸含量(%)和残糖（以还原糖计）含量（%）为指标。结果如表 3.5。 通过表 3.5 的正交实验可以看出，在黑曲霉 Wys-03 柠檬酸发酵过程中，培养基的三个营养因子对柠檬酸发酵的影响大小顺序是：初始总糖浓度(g/v%)

43、(NH4)2SO4 添加量(g/100ml)玉米液化全液添加量(v/v%)。从正交实验表中可以看出，最优培养基成分是：18%的初糖含量，17%的玉米液化全液添加量，0.3%的(NH4)2SO4 添加量效果最好。但是正交实验中并没有做这个实验，而实验 4 与本最佳实验最为相似。为了确定最优发酵条件，根据上述最优方案进行了一次柠檬酸发酵实验，发酵最终柠檬酸含量为 13.64g/100mL，高于正交试验中的实验 4，所以选择最优方案为以后的发酵营养条件。3.5.2 非营养因子对柠檬酸产量的影响控制发酵培养基中的营养因子可以有效的提高柠檬酸的发酵产量，但是影响柠檬酸发酵的不止有发酵培养基中的营养因子同

44、时还有发酵工艺参数。3.5.2.1pH 值对柠檬酸产量的影响由于酶活受 pH 值的影响十分明显，所以发酵培养基中不同 pH 直接影响发酵微生物的代谢过程，同时发酵培养基的 pH 还对微生物的生长影响较大。由于发酵过程中的 pH 不合适，可能影响菌体的生长发育进而影响菌种产物的合成的速率和能力，因此了解不同发酵微生物的最适发酵 pH 对于提高发酵产物的产量有重要的意义（1）发酵液初始 pH 对柠檬酸发酵的影响：相对于大工业发酵罐发酵，实验室内的摇床三角瓶发酵，调节合适的发酵初始 pH 值十分重要。特别是像柠檬酸发酵这种以淀粉作为发酵原料的发酵，发酵液初始 pH 的高低会直接影响到菌体糖化酶的活力

45、，由于柠檬酸发酵是以玉米粉为原料的发酵过程，属于边糖化边生长边产酸的过程。初始 pH 值过低，会直接导致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同时较低发酵 pH 值，会生成亚铁氰化物，该化合物对黑曲霉菌体的生长有毒害作用。反之如果发酵液初始 pH 值较高，会使发酵过程中草酸和葡萄糖酸大量积累，使发酵液中杂酸含量过高。不同发酵液初始 pH 值对柠檬酸发酵产量的影响，见图 3.6。 由图 3.6 可可以看出，黑曲霉 Wys-03 在进行柠檬酸发酵时，只有发酵液初始pH 为 4.5 时，产酸率最高。如果发酵液初始 pH 调节过高或者过低时，都会对最后的产酸率有影响。究其原因主要是，pH4.5 与糖化酶的活

46、性最高 pH 值基本一致，如果起始 pH 低于 4，则低于糖化酶的作用最适范围，会使得发酵原料得不到充分利用，进而影响最终产酸率。反之如果发酵液初始 pH 过高，pH 值大于或者等于6，则黑曲霉菌丝球会出现老化现象，提前进入衰老期，如果初始发酵 pH 值更高还会引起菌体自溶。所以，发酵液初始最适 pH 值为 4.5。（2）柠檬酸发酵过程中 pH 值的变化 黑曲霉接种到发酵培养基以后，首先会分泌并利用自身的糖化酶系，将发酵液中未液化完全的大分子多糖水解为单分子葡萄糖，供给黑曲霉自身生长发育以及合成柠檬酸，如果发酵前期由于各种原因使得黑曲霉过早进入到发酵产酸期，由于柠檬酸的积累从而引起发酵液的 pH 值下降，过低的 pH 值就会抑制黑曲霉糖化酶的活力，进而影响原料的糖化，不仅影响黑曲霉菌丝球的生长发育，而且还影响最终产酸率和转化率。因此，在发酵前期保持培养基的 pH 值稳定，使 pH 值保持在 45 之间，当菌丝球开始进入到柠檬酸大量累积