建立TCRγ基因长度谱型方法分析疾病中淋巴细胞克隆的消长

1、建立TCR基因长度谱型方法分析疾病中淋巴细胞克隆的消长/ T淋巴细胞具有重要的免疫功能1。我们建立了分析T细胞受体(TCR)基因谱系的方法，分析病情中/ T淋巴细胞各个克隆的消长变化及这些变化与疾病的关系。利用不同克隆的TCR基因重排后的CDR区长度不同，建立一种分析淋巴细胞各个不同克隆的方法，称之为CDR区长度谱型。用这种方法对一些正常人和患者的/ T淋巴细胞的克隆变化进行分析，证明这种方法是观察淋巴细胞的主要克隆群落的分布，监测其发育过程及受抗原刺激后的动态变化的较好的途径。 材料和方法1标本10名健康成人(2540岁，男、女各5名)外周血标本，其中3人有不同时间的标本； 3例非霍奇金淋巴

2、瘤标本；1个CEM细胞株（人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞株）。2方法2.1DNA的提取：提取外周血单个核细胞的DNA。2.2引物：根据Lefranc等2报道的TCR基因序列设计，TCR基因6个有功能的V区的引物作为上游引物，选择共同的J区引物作为下游引物（表1）。对照选用ras-61基因，序列为N-61-1:5-GTTATAGATGGTGAAACCTG-3; N-61-2:5-ATACACAGAGGAAGCCTTCG-3。表1TCR V家族引物序列引物DNA编码序列PCR产物的长度(bp)V2TCCAGGGAAGTATTATACTTAC170V3TACTATGACGTCTCCACCGGTT21

3、0V4GGAATCAGGAATCAGC190V5AGCTGGATATTGATACTACGGTA140V8GAAAATGCCGTCTACAC280V9ACAGTTCCTGGTGTCCATTTCAAG230J1/2TGTTGTTCCACTGCCAAA 2.3聚合酶链反应（PCR）: 操作按常规方法3进行。总反应体系为25 l，其中DNA模板1 l（1 g/l），10 mmol/L dNTP（dATP,dCTP,dGTP和dTTP）, 同位素35S-dATP 185 kBq（0.5 l）,V、J引物浓度均为0.5 mol/L，N-ras基因引物浓度为0.25 mol/L。0.5 UTaq聚合酶，反应

4、在PCR缓冲液（1 mmol/L Tris-HCl pH8.3, 5 mmol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2）中进行。反应条件：94 2分钟后，93 变性30秒，56 退火 30秒，72 延伸 1分钟，共30个循环，然后72 10分钟，结束反应。2.4CDR3区长度谱型分析： PCR反应产物1 l加SSCP上样缓冲液（体积分数为95%的甲酰胺缓冲液）1 l,于98 热变性2分钟，置于冰浴中待上样。电泳选用测序胶（60 g/L聚丙烯酰胺凝胶，7 mol/L尿素），55 恒温下电泳2小时，电压2 500 V，功率125 W。2.5放射自显影：将电泳后凝胶去除尿素后干燥，曝光36小时后

5、显影。 结果1正常人外周血淋巴细胞克隆的分布分析10名正常人发现，不同人的/ T细胞克隆分布总体上是一致的。不同V区大约可观察到十余条条带，其中V3，V8，V9基因观察到的条带较多，而V2和V4的条带强度较高而数量偏少。V5的条带强度最弱，这些条带总共代表大约数百个克隆。总的看来，不同个体/ T细胞在各个V区的条带强度和数量分布是一致的，仅个别条带强弱不同，表明不同个体淋巴细胞的克隆大小稍有差异，见1。 a：第1次取样时外周血标本；b：1年后标本11名正常人2年中2次取外周血标本的谱2同一正常个体不同时间的各淋巴细胞克隆大小1中1名正常人间隔两年外周血标本的谱显示，两个时间的克隆分布和大小基本

6、一致，表明这些克隆的大小和分布是稳定的。有个别条带的某一时间增强而在另一时间不增强，表明某一时间一个/ T细胞克隆，在外周循环中发生扩增，过一段时间刺激消失，克隆又可能缩小。3长度谱型能够反映淋巴细胞克隆种类和大小的变化3.1单克隆细胞系只显示其本身具有的两种重排条带。CEM淋巴细胞白血病细胞系，已发现其为V3/V4双等位基因重排。在长度谱型的V3和V4泳道出现强度较高的单一条带，而其它V区无条带，反应中加入了ras基因作为内参照，排除由于操作失败而引起的条带缺失(见2)。2CEM细胞系的基因长度谱型3.2正常人标本可以获得近百条以上的条带（1），反映了正常人的淋巴细胞是多克隆性的。3.33例

7、非霍奇金淋巴瘤患者的外周血正常淋巴细胞（已用基因分析法排除存在肿瘤细胞）标本显示，在各个V区的条带数量明显减少，而出现数个强度增强的条带，表明正常淋巴细胞呈寡克隆增生(见3)。 31例血液系统肿瘤患者标本的谱讨论正常人的/ T细胞有许多的克隆，能够识别各种各样不同的外来抗原，如果丧失了某些克隆，意味着患者出现某种免疫缺陷4，5。因此，有必要寻找一种能确切地分析T细胞中某些克隆的方法。由于/ T细胞具有包括抗感染、肿瘤监测和防御的作用，以及参与自身免疫疾病的致病机制等许多重要功能，这些功能是机体免疫监测和防御功能的重要组成部分，因此我们试利用不同TCR基因V区重排代表/ T细胞各个克隆，来观察正

8、常人和一些患者的/ T细胞克隆的分布及总的克隆谱系在疾病时发生变化的过程，这样做的目的是为了了解/ T细胞各个有功能克隆与疾病间的对应关系。我们建立了一种方法,由于每个淋巴细胞克隆都有自己特征性的TCR基因重排，将这些重排基因进行PCR扩增和变性胶电泳后，每一个较大的克隆在长度谱型上表现为一条位置固定的条带。这样可以区分各个不同的优势淋巴细胞克隆。分析10名正常人发现，不同人的T细胞克隆分布总体上是一致的。不同V区大约可观察到十余条条带，其中V3、V8、V9基因观察到的条带较多，而V2和V4的条带强度较高而数量偏少。V5的条带强度最弱，这些条带总共代表大约数百个克隆。同一个体在不同时间的长度谱

9、型是稳定的。在疾病情况下，淋巴细胞的分布发生变化。分析3例肿瘤患者发现他们的淋巴细胞克隆呈现一种寡克隆增生现象。因此，这些淋巴细胞克隆的增生显然与患病有关，值得进一步分析各克隆出现的意义。此方法可以用来研究骨髓移植以后的免疫功能重建、对肿瘤的免疫、对细菌超抗原的免疫等过程中淋巴细胞克隆的变化。作者单位：100034北京医科大学第一医院参考文献1Bluestone JA, Khattri R,Sciammas R,et al. TCR cells: a specialized T-cell subset in the immune system. Ann Rev Cell Dev Biol， 1

10、995，11:307-353.2Lefranc MP, Forster A, Baer R,et al. Diversity and rearrangement of the human T cell rearrangement genes: nine germ-line variable genes belonging to two subgroups. Cell,1986,45:237-2463Sambrook J,Fristch EF,Maniatis T. 分子克隆实验指南. 北京：科学出版社，1992.672. 4陈文杰,主编.血液细胞分子生物学. 北京：中国医药科技出版社，1993. 205-241.5Gorski J,Yassai M,Zhu X,et al. Circulating T cell rep