粗多糖含量测定方法学验证

1、粗多糖含量测定方法学研究资料一、仪器与试药 1二、方法得研究 11、检测波长得测定 22、样品及对照制备方法 2三、方法学验证 21、线性 22、精密度实验 33、稳定性实验 44、重复性试验 45、重现性实验 46、准确度试验 5芪参颗粒粗多糖含量测定方法起草说明 标志性成分粗多糖含量测定得方法来源于保健食品功效成分检测方法白鸿主编( 中国中医药出版社 )得第二法 ,该方法得原理就是 :多糖经乙醇沉淀分离后 , 去除其她可溶性糖 及杂质得干扰 , 糖与硫酸在沸水浴中加热脱水生成羟甲基呋喃甲醛 ( 羟甲基呋喃糠醛 ), 再与 蒽酮缩合成蓝绿色化合物 ,其显色强度与溶液中糖得浓度成正比 ,在 6

2、25nm波长下比色测定。主要研究资料如下 :一、仪器与试药1、仪器(1) 离心机 (湘南湘仪实验室仪器开发有限公司 ,型号 TD25-WS);(2) 离心管 :50ml;(3) 水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司 ,型号 DK-S26);(4) 旋涡混合器 (DioCote,SA8);(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可见光分光光度计 ;(6) JB760-68 石英比色皿 (宜兴市伟鑫仪器有限公司 );(7) TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司 );2、试药(1) 葡萄糖 :广州化学试剂厂 ,分析纯 , 批号为 20110602-1;(2)

3、 无水乙醇 : 西陇化学股份有限公司 , 分析纯 , 批号为 160802 1;(3) 蒽酮 :国药集团化学试剂有限公司 ,分析纯 , 批号为 ;(4) 硫酸 :广州化学试剂厂 ,分析纯 ,批号为 20150404-1;(5) 葡萄糖标准液 :标准称取干燥恒重得分析纯级葡萄糖0、 5000g,加水溶解 ,并定容至50ml,此溶液 1ml 含 10mg 葡萄糖 ,用前稀释 100 倍为使用液 (0、 1mg/ml)。(6) 0、1%蒽酮硫酸溶液 (W/V): 准确称取 0、1g 蒽酮置于烧杯中 ,缓缓加入 100ml 80% 硫 酸溶解 ,溶解后呈黄色透明溶液。现用现配。3、试样(1) 样品颗粒

4、 :XXXXX 有限公司提供。二、方法得研究粗多糖含量测定得方法来源于保健食品功效成分检测方法白鸿主编 ( 中国中医药出 版社)得第二法 ,本研究针对葡萄糖对照以及样品得得吸光度进行检测波长测定 ,如下所示 :1、检测波长得测定取葡萄糖对照品溶液、样品溶液进行紫外光谱扫描,结果显示对照品与样品均在625nm波长附近有最大吸收。序号12波长760、 00624、 50吸光度0、 0550、154葡萄糖对照品紫外波长吸收图2、样品及对照制备方法(1) 样品提取 : 称取混合均匀得固体样品2、, 加水 80ml 左右 , 于沸0g, 置于 100ml去初滤液 , 收集余下滤液序号波长吸光度1625、

5、000、3602509、500、2713 芪参颗粒样品4溶2液2、紫5外0 波长吸0收、图26水浴中加热 1小时, 冷却至室温后补加水至刻度 (V1), 混匀后过滤 , 弃供沉淀粗多糖。(2) 沉淀粗多糖 :准确吸取上滤液 (或液体样品 )5 、0ml(V2), 置于 50ml离心管中 (或2、0ml于15ml具塞离心管中 ), 加入无水乙醇 20ml( 或8ml), 混匀 ,于4冰箱静置 4小时以上 , 以4000r/min 离心5min,弃去上清液 ,残渣用80%(V/V)乙醇溶液数毫升洗涤 ,离心后弃去上清液 ,反复操作 3次。残渣用水溶解并定容至 10ml(V3) 。(3) 标准曲线得

6、绘制 : 准确吸取葡萄糖标准使用液 0ml、0、20ml、0、40ml、0、60ml、 0、80ml 、1、0ml 、1、2ml( 相当于葡萄糖 0mg、0、02mg、0、04mg、0、06mg、0、08mg、0、10mg、0、 12mg)置于10ml比色管中 ,补加水2、0ml,加入0、1%蒽酮硫酸溶液 6ml, 在旋涡混合器上混 匀, 置沸水浴中加热 10min, 取出,在流水中冷却 20min后, 用分光光度计在 625nm波长处以试剂空白为参比 ,1cm比色皿测定吸光度值。 以葡萄糖质量为横坐标 , 吸光度值为纵坐标 , 绘制标准 曲线。(4) 样品测定 :准确吸取样品待测液 2、 0

7、ml(含糖量 20 100g), 按标准曲线绘制步骤于 625nm波长下测定吸光度值并求出样品含量。三、方法学验证1、线性取适量葡萄糖对照品 ,精密称定 ,加水制成 0、 1094mg/ml 得葡萄糖对照品储备溶液 ,分别 精密吸取葡萄糖对照品储备溶液 0ml、0、20ml 、0、40ml、0、60ml、0、80ml、1、0ml、1、 2ml,置于 10ml 比色管中 ,补加水 2、 0ml ,依法测定。得标准曲线储备液。依法测定,分别制成含葡萄糖为 0、21、 88g、43、76g、65、44g、 87、52g、109、40g、131、 28g得溶液,以吸光度 (Y) 为纵坐标 ,葡糖糖对照

8、品得含量 (X) 为横坐标 ,绘制标准曲线 ,见下图 ,其回归方 程为 : y=0 、00507x+0、0048(r=0、99989),试验表明葡萄糖对照品在 0 131、 28 g范围内呈 良好线性关系。见表 1。表1 线性考察结果含量0 21、 8843、7665、4487、 52109、40131、28( g)吸光度 ( Y)-0 、 0 、0、22090、33720、 44310、55610、6635回归方程0007 1111y=0、 00507x+0 、 0048r=0 、 9999粗多糖标准曲线如下 :粗多糖对照在 0 131、 28g 内成良好得线性关系。2、精密度实验取一供试品

9、溶液 ,连续测定 6 次,记录吸光度 ,结果见表 2。试验结果 RSD< 2、0(RSD 0、44 ,n 6),说明仪器精密度良好。表2 仪器精密度试验测定结果序号吸光度平均吸光度RSD10、339820、341430、34070、34180、 4440、343550、343660、34193、稳定性实验取同一样品 ,按以下时间测定 ,记录吸光度 ,结果见表 3。表 3 粗多糖稳定性试验结果时间0min 30min1h2h3h4h吸光度0、34370、34090、33970、33700、 3342033131hRSD(%)0、602hRSD(%)0、824hRSD(%)1、35结果表明供

10、试品溶液在显色反应完成后4 小时内稳定。4、重复性试验取同一供试品 ,按供试品制备方法制备 6 份供试品溶液 ,并按样品及对照制备方法 测定粗 多糖含量 ,结果见表 4。表 4 粗多糖重复性试验测定结果 （单位:mg/100g）样品编号123456含量 (mg/100ml)348343335330335338平均含量338RSD(%)1、91结果表明 6 份供试品溶液按照粗多糖得检测方法测定重复性好。5、中间精密度实验取同一供试品 （批号 :150401）,由另一操作者于不同时间、不同仪器操作,按供试品制备方法制备 6 份供试品溶液 ,并按样品及对照制备方法 测定粗多糖含量 ,结果见表 5。表

11、 5 粗多糖中间精密度试验测定结果 （单位:mg/100g）标准曲线结果含量( g)020、 3240、6460、9681、28101、6121、92吸光度 （ Y）00、0980、 1960、2960、3940、5060、575回归方程y=0、0048x+0 、0015r=0 、9992样品测定结果 :样品编号123456含量 (mg/100ml)294285297273297287289平均含量RSD(%)3、20结果表明 6 份供试品溶液按照粗多糖得检测方法测定进行得中间精密度实验精密度良 好。6、准确度试验采用加样回收法 ,精密称取本品 (批号 :150401,平均含量 :338mg/

12、100g, 平均吸光度 :0、 3449)2、0g各 6 份,按照样品及对照制备方法 中制备得样品待测液 6 份,分别从 6份待测液中 吸取 1ml 置于 10ml 比色皿中 ,再分别精密加入 1ml 100% 浓度得对照品溶液 (浓度 :0、 03402mg/ml), 依法进行测定 ,记录吸光度 ,以吸光度计算回收率 ,结果见表 6。6 份样品回收率均 在 95%105%之间 ,平均回收率为 103%,RSD=0 、 78%,该方法准确度符合要求。表 6 粗多糖回收率试验结果编号取样量 (g) 样品吸光度对照品加入量(mg)对照 测得吸光度加入对照后 总吸光度回收率(%)平均值(%)RSD (%)12、00270、17240、034020、1688