第三章细胞生物学研究方法(xiugai)

1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法本章内容提要本章内容提要 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜一、光学显微镜 二、电子显微镜二、电子显微镜 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 形态观察是细胞生物学最基本的研究方法形态观察是细胞生物学最基本的研究方法其工具主要为显微镜。其工具主要为显微镜。 根据光源的不同，可将显微镜分为：根据光源的不同，可将显微镜分为： 光学显微镜光学显微镜 可见光和紫外光可见光和紫外光 电子显微镜

2、电子显微镜 电子束电子束 在光学显微镜中，照明系统是可见光，在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像屏观察样品的镜像、光学显微镜技术、光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜一）普通复式光学显微镜1. 1. 构成：构成：照明系统照明系统: : 光源和聚光镜光源和聚光镜, ,有的还有折光有的还有折光镜，有时附加滤光片控制光的波长。镜，有时附加滤光片控制光的波长。光学放大系统光学放大系统:

3、 : 目镜和物镜组成。目镜和物镜组成。机械和支架系统：机械和支架系统：主要保证光学系统的主要保证光学系统的准确配置和灵活调控准确配置和灵活调控2. 2. 原理：原理：经经物镜形成倒物镜形成倒立实像，经立实像，经目镜放大成目镜放大成虚像。虚像。3. 分辨率分辨率 透镜最重要的性质是它的透镜最重要的性质是它的分辨率分辨率，是指能分辨，是指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力（区分开出的相邻两个物点间最小距离的能力（区分开两个质点间的最小距离）两个质点间的最小距离） ，这种距离称为，这种距离称为分辨分辨距离距离。分辨距离越小，分辨能力越高。分辨距离越小，分辨能力越高。一般规定：显微镜或人眼在一般规

4、定：显微镜或人眼在25cm25cm明视距离处，能明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称为分辨率。人眼分辨率是称为分辨率。人眼分辨率是100um100um; ;光学显微镜光学显微镜的最大分辨率是的最大分辨率是0.2um0.2um光学显微镜的分辨率光学显微镜的分辨率D D = 0.61/(= 0.61/(N.N.sin/2)sin/2)其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角，也物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角，也称角孔径）；称角孔径）；NN=介质折射率；介质折射率； N.N.sin/2sin/2的量称

5、为物镜的数值孔径的量称为物镜的数值孔径(numerical (numerical aperture),aperture),缩写为缩写为NA,NA,因此，显微镜的分辨率公因此，显微镜的分辨率公式可表示为式可表示为D D = 0.61/= 0.61/NANA。NANA被刻在物镜镜筒外侧和聚光被刻在物镜镜筒外侧和聚光镜上镜上显微镜的几个光学特点显微镜的几个光学特点n介质折射率越接近镜头玻璃的（介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 1. 7 ）越好。）越好。空气中空气中N N = 1= 1，油镜介质为香柏油，介质折射，油镜介质为香柏油，介质折射率可接近率可接近1.5 1.5 ；n最好的玻璃透镜的镜口

6、角是最好的玻璃透镜的镜口角是140140，sin/2sin/2的的最大值为最大值为0.940.94；n可见光的波长范围为可见光的波长范围为400700nm400700nm，而可见光，而可见光中的蓝色光的波长最短，为中的蓝色光的波长最短，为450nm450nm；n用空气作介质，普通光镜的最大分辨率约为用空气作介质，普通光镜的最大分辨率约为0.3um0.3um，用油作介质，最大分辨率为，用油作介质，最大分辨率为0.2um0.2um，人眼的分辨力为人眼的分辨力为0.2mm0.2mm，因此普通光学显微镜，因此普通光学显微镜的最大有效倍数为的最大有效倍数为1000X1000X。光镜样本制作光镜样本制作样

7、品样品固定固定( (甲甲醛醛)包埋包埋( (石蜡石蜡)切片切片(5um)(5um)染色染色（如伊红和美蓝能（如伊红和美蓝能与蛋白质结合；品与蛋白质结合；品红能与红能与DNADNA结合）结合） 大多数细胞总重量的大多数细胞总重量的70%70%是水，对可见光几乎是水，对可见光几乎是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。如苏木精特征。如苏木精(hematoxylin)(hematoxylin)对负电荷分子有亲对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料和性，能显示

8、出细胞内核酸的分布；酸性染料如如伊红伊红(eosin)(eosin)可使细胞质染色；可使细胞质染色；苏丹染料苏丹染料(Sudan (Sudan dyes)dyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。（二）倒置显微镜（二）倒置显微镜 倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，样， 所不同的只是它的物镜与照明系统所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。前者置于载物台之下，的位置颠倒过来。前者置于载物台之下， 而后者在载物台的上方。聚光器与载物而后者在载物台的

9、上方。聚光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置培养台之间的工作距离提高，可以放置培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行照明和观察。进行照明和观察。（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)(Fluorescencemicroscope) 以紫外线为光源照射被检物体，使之发出以紫外线为光源照射被检物体，使之发出荧光（自发荧光、次生荧光），然后在荧光（自发荧光、次生荧光），然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置。显微镜下观察物体的形态及其所在位置。用于研究细胞内物质的吸收、运输以及用于研究细胞内物质的吸收、运输以及化学

10、物质的分布及定位等。能对特异蛋化学物质的分布及定位等。能对特异蛋白质等生物大分子进行定性定位研究。白质等生物大分子进行定性定位研究。荧光显微镜荧光显微镜特点：光源为短波光；特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射照明方式通常为落射式。式。尼康尼康E800E800荧光荧光DICDIC显微镜荧光显微镜显微镜荧光显微镜荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1. 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；于样品上；2. 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显光源为紫外光，波

11、长较短，分辨力高于普通显微镜；微镜；3.3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。护人目。用于观察能激发出荧光的结构。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。疾病诊断。叶绿体自发荧光叶绿体自发荧光（四）相差显微镜（四）相差显微镜1934-1935 1934-1935 荷兰物理学家荷兰物理学家Zernike Zernike 设计和发明相设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。差显微镜，并获得诺贝尔奖。 相差显

12、微镜在结构上进行了特别设计，尤其是相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很大的不同，可用于观察未染色的光学系统有很大的不同，可用于观察未染色的活细胞，提高活细胞活细胞，提高活细胞结构反差。结构反差。 基本原理基本原理：把透过标本的可见光的：把透过标本的可见光的光程差光程差变成变成振幅差振幅差，从而提高细胞各种结构间的对比度，从而提高细胞各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。使各种结构变得清晰可见。相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：特殊之处：1. 1.环状光阑（环状光阑（annular diaphragmannular diaph

13、ragm）：位于光源）：位于光源与聚光器之间。与聚光器之间。2. 2.相位板（相位板（phase platephase plate）：物镜中加了涂有氟）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟相位推迟1/41/4。光光学学部部件件及及光光线线通通路路（五）暗视野显微镜（五）暗视野显微镜（dark fieldmicroscopedark fieldmicroscope） 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，光线

14、进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。可观察物体边缘是亮的。可观察4200nm4200nm的微粒的微粒子，分辨率比普通显微镜高子，分辨率比普通显微镜高5050倍。倍。（六）荧光漂白恢复技术（六）荧光漂白恢复技术（FRAP)起源于起源于2020世纪世纪7070年代，使用年代，使用与蛋白质或脂质耦联的亲脂与蛋白质或脂质耦联的亲脂性或亲水性的荧光分子，如性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等，荧光素、绿色荧光蛋白等，检测活体细胞表面或细胞内检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及各种结构部的分子运动以及各种结构上分子动态变化率的大小。上分子动态变化率的大小。二、电子显微镜二、电子显微

15、镜 19321932年年RuskaRuska发明了以电子束为光源的透射发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（电子显微镜（transmission electron microscopetransmission electron microscope，TEMTEM），电子束的波长要比可见光和紫），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，利用样品对电子的散射和外光短得多，利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差成像。透射形成明暗反差成像。（一）、激光扫描共聚焦显微镜一）、激光扫描共聚焦显微镜 激光扫描共聚焦显微镜是在传统荧光显激光扫描共聚焦显微镜是在传统荧光显微镜成像的基础上，采用激光作为光源，微镜成

16、像的基础上，采用激光作为光源，使用激光扫描装置和共轭聚焦装置，利使用激光扫描装置和共轭聚焦装置，利用微机控制的数字化图像采集和处理的用微机控制的数字化图像采集和处理的技术。技术。 用于荧光组织光学切片分析用于荧光组织光学切片分析,3维图像重维图像重建分析建分析,细胞物理和生物化学测定细胞物理和生物化学测定(如分如分子扩散子扩散,膜电位膜电位)研究研究,荧光定量和定位分荧光定量和定位分析析,细胞中离子的实时定量分析细胞中离子的实时定量分析, 荧光漂荧光漂白恢复研究（白恢复研究（FRAP）技术研究，胞间）技术研究，胞间通讯研究，细胞膜流动性测定。通讯研究，细胞膜流动性测定。 激光扫描共聚焦显微镜（

17、1 1）超薄切片）超薄切片 用于电镜观察的标本须制成厚度仅用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm50nm的的超薄切片，用超薄切片超薄切片，用超薄切片（ultramicrotomeultramicrotome）制作。制作。通常以锇酸和戊二醛通常以锇酸和戊二醛固定固定样品，丙酮逐样品，丙酮逐级级脱水脱水，环氧树脂，环氧树脂包埋包埋，以热膨胀或螺，以热膨胀或螺旋推进的方式旋推进的方式切片切片，重金属（铀、铅），重金属（铀、铅）盐盐染色染色。制制制样样样技技技术术（二）主要电镜制样技术介绍（二）主要电镜制样技术介绍(2) (2) 负染技术（负染技术（Negative stainingNegative

18、staining）用重金属盐用重金属盐( (如磷钨如磷钨酸或醋酸双氧铀酸或醋酸双氧铀) ) 染染色；吸去染料干燥色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，了一层重金属盐，而凸出的地方没有而凸出的地方没有染料沉积，从而出染料沉积，从而出现负染效果，分辨现负染效果，分辨力可达力可达1.5nm1.5nm左右。左右。(3)冰冻蚀刻冰冻蚀刻 freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将构。向断裂面上喷

19、涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（膜（replicareplica）。）。 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。分子基本手段。 转速小于转速小于2500r/min2500r/min的离心机称为的离心机称为高速离心机高速离心机。 转速转速2500-50000r/min2500-50000r/min，称为，称为超速离心机超速离心机。转速高于转速高于50000r/min50000r/min，称为，称为超高速离心机超高速离心机。 目前超速离心机的最高转

20、速可达目前超速离心机的最高转速可达100000r/min100000r/min一、离心技术一、离心技术第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法1）差速离心差速离心（different centrifugationdifferent centrifugation）用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核沉降顺序：核线粒体线粒体溶酶体溶酶体内质网与高尔基内质网与高尔基体体核蛋白体。核蛋白体。Low speedHigh speed2）密度梯度离心密度梯度离心 用途：分离密度不等的颗粒。（速度沉降和等密度沉降）用途：分离密度不等的颗粒。（速度

21、沉降和等密度沉降）常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 原理：原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。从而将不同密度的成分分离。速度沉降速度沉降(velocity sedimentation )用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗

22、粒的最小密度。分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离系数以不同的速度沉降而达到分离等密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation用途：分离密度不等的颗粒。用途：分离密度不等的颗粒。特点：特点：n介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。密度。n所需的力场通常比速率沉降法大所需的力场通常比速率沉降法大1010010100倍，往往需要高速或超速离心。倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续

23、梯度的介质中经过一定时间的离心则沉原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。不同密度的成分分离。二二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法原理：原理：利用一些利用一些显色剂显色剂与所检测物质的与所检测物质的特殊集团特殊集团特异性结合，特异性结合，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断检测物质的分通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断检测物质的分布和含量。布和含量。福尔根（福尔根（Feulge

24、n）反应）反应DNA的分布的分布PAS反应反应多糖的存在多糖的存在细胞中的醛细胞中的醛基可使希夫基可使希夫试剂中的无试剂中的无色品红变成色品红变成红色红色酶的显示酶的显示酸性磷酸酶的显示酸性磷酸酶的显示 免疫细胞化学（免疫细胞化学（immunocytochemistryimmunocytochemistry）是根据免疫学原理，）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的蛋白。如果将抗

25、体结合上标记浆细胞针对特定的抗原分泌的蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位出该抗原存在于组织中的部位。 三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性一般步骤：一般步骤：1 1、抗原的选择、抗原的选择2 2、抗体的分离与提纯、抗体的分离与提纯3 3、抗体的标记、抗体的标记4 4 、标记抗体引入组织细胞、标记抗体引入组织细胞5 5 、光镜或电镜样品制备、光镜或电镜样品制备6 6、染色观察、结果分析、染色观察、结果分析用途：用途：1 1）对细胞表面或细胞内部的抗原进行定

26、位；）对细胞表面或细胞内部的抗原进行定位；2 2）了解抗体合成过程中的动态变化；）了解抗体合成过程中的动态变化；3 3）抗原）抗原抗体复合物结构细节；抗体复合物结构细节；4 4）鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化等。）鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化等。 常用的标记物有荧光素和酶：常用的标记物有荧光素和酶：荧光素标记的称为免疫荧光法（荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescentimmunofluorescent techniquetechnique）常用的）常用的荧光素有荧光素有异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（fluoresceinfluorescein isothiocyanate

27、isothiocyanate）、）、罗丹明罗丹明（rhodaminerhodamine）等。）等。酶标记的称为酶标免疫法酶标记的称为酶标免疫法(enzyme-labeled(enzyme-labeled antibodyantibody method)method)，常用的酶，常用的酶有有辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradishhorseradish peroxidaseperoxidase），酶与底物发生反应），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 （一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术免疫荧光法特点：快速

28、、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。免疫荧光法特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。（二）（二）免疫电镜技术：免疫电镜技术： 免疫铁蛋白技术：铁蛋白提取繁琐，分子量大，不易进入免疫铁蛋白技术：铁蛋白提取繁琐，分子量大，不易进入细胞。细胞。 免疫酶标技术：反应没有特异性，不能进行感受部位的点免疫酶标技术：反应没有特异性，不能进行感受部位的点对点对应。对点对应。 免疫胶体金技术：是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原免疫胶体金技术：是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是直径胶体金是直径1-100nm1-100nm的金的金颗粒分散在水中

29、形成的金溶胶。特异性强，容易识别。分辨颗粒分散在水中形成的金溶胶。特异性强，容易识别。分辨率高。率高。应用：应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。免疫胶体金技术免疫胶体金技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA杂交的双链分子。这种技术

30、可用来测定单链分子杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。核苷酸序列间是否具有互补关系。Southern blot检测基因的拷贝数检测基因的拷贝数Northern blot检测某种基因时空表达检测某种基因时空表达 原位杂交原位杂交基因在细胞内或染色体上基因在细胞内或染色体上的定位及其表达的定位及其表达四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交技术：原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交用标记的核酸探针通过分子杂交, ,经放射自经放射自显影或非放射检测体系，确定特殊核苷酸序列在染色体或显影或非放射检测体系，确定特殊核苷酸序列在染色体或

31、细胞中位置的方法。细胞中位置的方法。分分RNARNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。最初是使用放原位杂交和染色体原位杂交两大类。最初是使用放射性射性DNADNA探针，后来又发明了免疫探针法。探针，后来又发明了免疫探针法。 光镜水平的原位杂交技术：光镜水平的原位杂交技术：用同位素标记或荧光素标用同位素标记或荧光素标记探针。记探针。 电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术 ：生物素标记的探针与抗生生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合。物素抗体相连的胶体金标记结合。（一）原位杂交（一）原位杂交（in situ hybridization）1、RNA原位杂交原位杂交标记特异性探针标

32、记特异性探针RNA被固定的组织切片被固定的组织切片若细胞中存在与探针互补的若细胞中存在与探针互补的mRNA分子分子放射自显影或酶促免疫显色放射自显影或酶促免疫显色放射性物质或非放射性（如地高辛、生物素）放射性物质或非放射性（如地高辛、生物素）对该基因的表达产物在细胞对该基因的表达产物在细胞水平上做出定位定量的分析水平上做出定位定量的分析反应反应 荧光原位杂交显示的端粒荧光原位杂交显示的端粒 2、荧光原位杂交技术、荧光原位杂交技术FISH（fluorescence in situ hybridization）荧光原位杂交显示的人体着丝粒卫星荧光原位杂交显示的人体着丝粒卫星DNA 检测荧光素来确定

33、与探针检测荧光素来确定与探针DNA序列杂交的序列杂交的互补序列在染色体或互补序列在染色体或DNA 上的位置上的位置荧光素标记探针荧光素标记探针DNA染色体染色体DNA（二）分子杂交技术（二）分子杂交技术SouthernSouthern杂交杂交：是体外分析特异：是体外分析特异DNADNA序列的方法，序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核操作时先用限制性内切酶将核DNADNA或线粒体或线粒体DNADNA切成切成DNADNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用纤维薄膜上，再用DNADNA探针杂交，通过放射自显探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互

34、补的特殊核苷序列。影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将将RNARNA转移到薄膜上，用转移到薄膜上，用DNADNA探针杂交，则称为探针杂交，则称为NorthernNorthern杂交。杂交。分子杂交实验分子杂交实验目的：目的：用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使段时间后，制取切片，涂

35、上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。乳胶感光。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。五、放射自显影技术五、放射自显影技术一般用一般用1414C C和和3 3H H标记。常用标记。常用3 3H-TDRH-TDR来显示来显示DNADNA，用，用3 3H-UDRH-UDR显示显示RNARNA；用；用3 3H H氨基酸研究蛋白质，用氨基酸研究蛋白质，用3 3H H甘露糖、甘露糖、3 3H H岩藻岩藻糖研究多糖。糖研究多糖。六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry

36、Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质( (如核酸与蛋白质等如核酸与蛋白质等) )在细胞内的含量。在细胞内的含量。 包括：包括： 紫外光显微分光光度测定法紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法l 流式细胞仪（流式细胞仪（Flow CytometryFlow Cytometry） 主要应用：可定量测定细胞中的主要应用：可定量测定细胞中的DNADNA、RNARNA或某一特异蛋或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群白的含量；测定细胞群

37、体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离体中分离某些特异染色的细胞；分离DNADNA含量不同的中期染含量不同的中期染色体。色体。第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养 1. 动物细胞培养动物细胞培养 （原代细胞培养，永生细胞系）（原代细胞培养，永生细胞系） 2. 植物细胞培养植物细胞培养 （单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养） 3. 非细胞体系非细胞体系 （DNA复制、复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡泡 运输，细胞核

38、装配等）运输，细胞核装配等） 细胞培养细胞培养 细胞培养技术也叫细胞克隆技术。指在细胞培养技术也叫细胞克隆技术。指在无菌条件下，模拟体内的生理环境，培无菌条件下，模拟体内的生理环境，培养从有机体中取出的细胞，使之生存和养从有机体中取出的细胞，使之生存和生长的技术。生长的技术。细胞培养的优点细胞培养的优点实验条件容易控制实验条件容易控制重复性好重复性好方法简便方法简便经济迅速经济迅速结果易分析结果易分析动物细胞培养动物细胞培养原代细胞（原代细胞（primary culture cell）继代细胞（继代细胞（subculture cell）指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的指从机体取出后立

39、即培养的细胞。有人把培养的第第2代细胞与传代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞代以内的细胞统称为原代细胞指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞细胞系（细胞系（cell linecell line）永生细胞系永生细胞系指从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志指从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。特点：的细胞群。特点：保持原来的二倍体数量和接触抑制保持原来的二倍体数量和接触抑制的行为的行为。指从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突指从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。变或转化的细胞，可无

40、限繁殖。特点：特点：呈亚二倍体或非整倍体；失去接触抑制的行为呈亚二倍体或非整倍体；失去接触抑制的行为。细胞在生长过程中，如果细胞细胞在生长过程中，如果细胞相互接触，则生长和增值受到相互接触，则生长和增值受到抑制，这种现象称为接触抑制抑制，这种现象称为接触抑制动物细胞培养动物细胞培养接触抑制接触抑制 细胞克隆：用单细胞克隆培养或通过药物细胞克隆：用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增值形成的，具有基本相细胞，并由此增值形成的，具有基本相同的遗传性状的细胞群体。同的遗传性状的细胞群体。细胞株细胞株(cell strain)(ce

41、ll strain)：经过生物学鉴定，如具：经过生物学鉴定，如具有特殊的遗传标记或性质，由单细胞增有特殊的遗传标记或性质，由单细胞增殖形成的细胞群体。殖形成的细胞群体。人的细胞培养人的细胞培养实验室中常见的几种细胞系Hela 细胞细胞(a) 和和 CHO (b) 细胞的培养细胞的培养细胞株细胞株1. 外植体培养：外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。2. 悬浮细胞培养：悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物

42、代谢产物。植物代谢产物。3. 原生质体培养：原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：培养脱壁后的细胞，特点：n比较容易摄取外来的遗传物质，如比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；n便于进行细胞融合，形成杂交细胞；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；n适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。4. 单倍体培养：单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。植物细胞培养植物细胞培养Plant Cell Culture植物组织培养原生质体培养原生质体培养植物组织培养是进行植物转基因的重要步骤植物组织培养是进行植物转基因

43、的重要步骤（一）细胞融合（一）细胞融合(cell fusion)(cell fusion)与细胞杂交技术与细胞杂交技术通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交细胞融合或细胞杂交。同核融合细胞：同核融合细胞：相同基因型的细胞融合而成。相同基因型的细胞融合而成。异核融合细胞：异核融合细胞：不同基因型的细胞融合而成。不同基因型的细胞融合而成。自发融合：自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。异种间

44、的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇）、化学方法（聚乙二醇PEGPEG）、物理方）、物理方法（电击和激光）。法（电击和激光）。 二、细胞工程二、细胞工程 （二）单克隆抗体技术（二）单克隆抗体技术 细胞拆合：把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质细胞拆合：把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质 和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。 物理法结合显微操作技术：用机械方法或激光把细胞核去物理法结合显微操作技术：用机械

45、方法或激光把细胞核去 掉或使之失活，然后用微吸管吸取其它细胞核，注入去核掉或使之失活，然后用微吸管吸取其它细胞核，注入去核 的细胞质中，组成新的杂交细胞。的细胞质中，组成新的杂交细胞。 化学法结合离心技术：用松驰素化学法结合离心技术：用松驰素B B处理细胞，离心，将细胞处理细胞，离心，将细胞 拆分为核体（拆分为核体（karyoplastkaryoplast）和胞质体）和胞质体cytoplastcytoplast）。在）。在PEGPEG 或仙台病毒介导下，核体与另一胞质体融合，形成重组细胞。或仙台病毒介导下，核体与另一胞质体融合，形成重组细胞。 体细胞体细胞-绿色荧光蛋白水母基因绿色荧光蛋白水母基因-取核取核-未受精卵未受精卵图为：美国密苏