二至丸对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件研究

1、二至丸对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件研究         【关键词】  二至丸；中药复方组合化学；血清药理学；细胞药理学；免疫调节；活性组分构件摘要：目的探讨二至丸免疫调节作用的活性组分构件。方法运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，观察女贞子、墨旱莲系列提取物及其组合物对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的作用。结果女贞子乙醇提取物、墨旱莲乙醇提取物、女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物（11）具有较强的丝裂原样作用，可以促进小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。结论二至丸对小鼠

2、淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件是女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物（11）。关键词：二至丸；  中药复方组合化学；  血清药理学；  细胞药理学；  免疫调节；  活性组分构件Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in MiceAbstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi

3、 Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese P

4、rescriptions, blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (11) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation o

5、f peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (11).Key words：Erzhi Pill;   Combinatorial Chemical research of Traditi

6、onal Chinese Prescriptions;   Blood serum pharmacology;   Cytopharmacology;   Immunoregulation;   Active components   二至丸是中医临床的经典名方，医便（明王三才）记载：“二至丸，清上补下第一方，价廉而功极大。”1它由女贞子、墨旱莲各等份组成，组方简单，药性平和，功效确切，作为补益肝肾良药。数百年来，倍受历代医家推崇。现代还用于衰老、神经衰弱、疲劳综合症及更年期综合症等疾病的治疗。

7、中成药二至丸先后被历版中国药典（部）和“第二批国家非处方药目录”收载。一些学者相继从现代药理学角度对其进行了研究，证明二至丸对机体免疫功能具有多方面的调节作用，但研究中多以水煎剂、女贞子多糖及方中单味药提取物给药25。由于目前对其复方药效物质基础及作用机理还缺乏系统规范的研究，致使制剂工艺粗放，日用剂量过大6，剂型落后，不符合现代中药要求，影响了它的公众认知度。作者在遵从复方配伍规律的前提下，以活性评价为导向，运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，对其免疫调节作用的有效组分构件进行探讨，以期进一步组成精简方剂，从而为二至丸的二次开发和临床应用提供科学实验数据。1  材料与

8、方法1   材料1.1   动物普通级 KM种小鼠，8周龄，体重2224 g，购于重庆市中药研究院实验动物研究室（许可证号：310101001）。1.2   试剂RPMIl640培养液 (Gibco产品)、无酚红 RPMIl640培养液 (Sigma产品)，配制时加青霉素1×105  IU/L、链霉素100 mg/L，过滤，使用时加体积分数为15% 的胎牛血清（FBS，超级，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，Fluka产品；LPS(脂多糖)，Sigma产品，用 RPMI1640配成1 mg/m

9、l，0.22 m过滤，分装，20冻存，临用前稀释。MTT(噻唑蓝)，Sigma产品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，过滤，4避光保存。硫代羟基乙酸钠 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所产品。其余试剂均为市售分析纯。1.3  仪器Napco6lOO型CO2培养箱，美国。96孔板，Nunclon，丹麦。微量可调加样器，Labsystems，芬兰。多头细胞收集仪，ZT型，上海医科大学。550型酶标仪，BioRad，美国。恒温水浴摇床，Yamato，日本。1.4   药物女贞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱莲 E

10、clipta prostrata L.（EPL），购于重庆市中药材公司，符合中国药典2005年版部规定。2   方法2.1   女贞子、墨旱莲提取物的制备取女贞子或墨旱莲药材，粉碎，过20目筛，依次用不同溶剂，10倍量提取2次，2 h/次，过滤，合并提取液，回收溶剂，制备女贞子或墨旱莲的石油醚提取物（简称 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（简称 NYSYZ或 HYSYZ）、乙醇提取物（简称 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（简称 NSJZ或 HSJZ）。临用前，分别用生理盐水（NS）制备药液，必要时可加少量 Tween80助溶，浓度相当于1 mg生

11、药/ml。2.2   含药血清的制备7小鼠按体重随机分组，每组10只，雌、雄各半。ig给药，给药2次，间隔2 h。ig容积10 ml/kg，空白血清组ig  NS，各含药血清组 ig相应组分6.7 g生药 /kg（组合组分13.4 g生药 /kg）。末次给药1 h，深度麻醉，心脏无菌采血，3000 r/min离心10 min，收集血清。同组分血清混合，56水浴30 min，-20冻存，临用前4冻融。2.3   细胞悬液的制备8小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），随即脱颈椎处死小鼠，ip P

12、BS 5ml，收集腹腔洗液，同时无菌取脾。常规方法制备细胞悬液，PBS液洗涤，离心，细胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培养液，调整浓度为2×106 cells/ml，台盼兰排除法检查细胞存活率大于95%。2.4   淋巴细胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）实验996孔细胞培养板，各给药组每孔加入50l淋巴细胞悬液、20 l含药血清和120 l RPMI164010%FBS培养液（对照组、刺激组分别用20 l空白血清），混匀后预孵1 h，再加入10 l ConA或 LPS（终浓度为5 g/ml）刺激（对照组用10 l PBS

13、），各设8个复孔。5% CO2培养箱（Forma.USA）37培养48 h后，加入 MTT 10 l/孔（10 mg/ml）培养8 h，弃上清，加入 DMSO 100 l/孔，MTT结晶充分溶解后，酶标仪570 nm处测定A值。2.5   腹腔巨噬细胞（PM）吞噬活性实验1096孔细胞培养板，各给药组每孔加入50 l腹腔巨噬细胞悬液、20 l含药血清和120 l无酚红 RPMI164010% FBS培养液（对照组用20 l空白血清），各设8个复孔。5% CO2培养箱（Forma.USA）37培养24 h，弃孔内培养基，加0.075%中性红溶液100 l/孔，培养1 h，弃上

14、清液，预温的 PBS液洗3遍，加入细胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：无水乙醇）100 l/孔，室温放置，过夜。次日，取上清液于酶标板中，酶标仪540 nm处测定A值。2.6   统计学处理采用 SPSS11.0统计软件包。运用单向方差分析（OneWay ANOVA），选用 Dunnett法进行组间显着性分析。实验数据以±s表示。         1  操红缨，梁颂名，荣向路，等二至丸对阴虚模型神经内分泌免疫网络调节作用的研究J.中药材，2000，23（2）：166.2

15、60; 段晓春旱莲草的研究概况J.中国临床医药实用杂志，2004，(12)：59.3  李葆华女贞子的研究状况J.中华医学研究与实践，2004，2(7)：49.4  李磷，丁安伟，孟丽二至丸免疫调节作用活性部位的研究J.中医药研究，2002；18(5)：42.5  刘大基，刘解生，徐继勋，等二至丸对小鼠淋巴细胞免疫功能的调节作用J.湖北中医杂志，2002，24(2)：48 .6  国家药典委员会中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2005：293.7  姚干，彭成，周东，等大川芎方对神经细胞缺血性损伤的保护作用M中成药，2004，26（4）：315.8  路景涛，杨雁，陈敏珠黄芪多糖对细菌脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞释放TNF、NO及IL1的影响J安徽医科大学学报，2004，39(2)：140.9  徐建芬，陈学群，杜继曾间断性低氧对大鼠淋巴细胞转化的影响J中国应用生理学杂志，2005，21(1)：5.10  梁文杰，刘东青，单保恩，等北豆根提取物对小鼠和人淋巴细胞及巨噬细胞作用的体外实验研究J中国免疫学杂志，2005，21(1)：56.11  周丽娟，许利平中药抗炎免疫药理免疫调节研究进展J中国中医基础医学杂志，2004，10（1）：79.