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文档简介

1、四川师范大学硕士学位论文S-腺苷甲硫氨酸高产菌株的筛选、诱变选育及其培养条件的优化姓名:叶盛申请学位级别:硕士专业:生物化学与分子生物学指导教师:李维20070601四师范大学硕士毕业论文腺苷甲硫氨酸高产菌株的筛选、诱变选育及其培养条件优化研究生物化学与分子生物学专业研究生叶盛指导教师李维摘要一腺苷甲硫氨酸(,简称为)广泛存在于各种生物体内,是人体内重要的生理活性物质,参与转甲基作用、多胺合成、转硫基作用等反应。在临床上,对于治疗肝病、抑郁症、关节炎等都具有一定的疗效,因此具有广阔的应用前景。但由于价格昂贵,目前还未能得到广泛的应用。为获得高产菌株,本论文展开了以下几方面的工作。首先,从自然界

2、中采集到个样品,从中分离得到株酵母菌菌株。通过对该株进行纸层析法初筛和法复筛,筛选获得株产量相对较高的菌株,命名为¥,其胞内含量为。对分离到的菌株¥进行了多轮诱变选育。通过对菌株¥进行亚硝基胍()诱变、乙硫氨酸筛选,获得抗性菌株株,其中突变株的胞内含量为,较菌株提高了倍。突变菌株一经诱变和低浓度(肛)制霉菌素筛选,获得制霉菌素抗性菌株株,其中突变株的胞内含量为。突变株再经紫外()诱变和高浓度(肛)制霉菌素抗性筛选,分离到抗性菌株株,并从中获得高产突变株一,其胞内含量为,较出发菌株¥提高了。突变菌株产的最佳培养基成分为:(:,。(),酵母粉,蔗糖,胰蛋白胨,蛋氨四川师范大学硕士毕业论文酸。突变菌

3、株在优化条件下发酵小时,胞内产量可达几,菌体生物量为。关键词:一腺苷甲硫氨酸酵母菌分离诱交培养基优化四拜巷大学硕士毕业论文:(哪,¥,蠹!,¥一(),四川师范大学硕士毕业论文,一。()¥一,一一一,一一(),皿吼,:;:四川师范大学学位论文独创性及使用授权声明本人声明:所呈交学位论文,是本人在导师奎缍副数握指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承诺:已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而引起的学术声誉上的损失由本人自负。本人同

4、意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定:学校作为申请学位的条件之一,学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥有学位论文的部分使用权,即:)己获学位的研究生必须按学校规定提交印刷版和电子版学位论文,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索;)为教学和科研目的,学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。论文作者签名卞壶年只四川师范大学硬士毕业论文第一章文献综述一腺苷甲硫氨酸(),又名一腺苷蛋氨酸,是一种广泛存在于生物体内的重要代谢中间物质“阁,也是人体内一种重要的生理活性物质,参与了多种生化反应洲,其常用缩写形式有,等。

5、首先由沁”发现,其分子式为,乩,分子量,分子结构图如图所示嘲。图腺苷甲硫氨酸分子结构图()一腺苷甲硫氨酸的生物学功用一腺苷甲硫氨酸的生物学功用主要体现在转甲基、转硫以及转氨丙基三个方面。转甲基作用是体内重要的甲基供体,参与体内许多物质的合成与代谢“。在甲基转移酶()催化下,提供甲基后生成(腺苷高半胱氨酸)州。丽生成的是转甲基反应的竞争性抑制剂,在含量上升以及含量降低或与比值降低的情况下都将抑制转甲基反应。许多含物质如:肌酸、松果素、胆碱、肾上腺素、甲氧肾上腺素、鹅肌肽、肉碱、肌碱、甲基组胺、四川师范大学硕士毕业论文甲菸酰胺等在生物合成时需从上获得甲基“一。此外,还参与核酸、蛋白质、磷脂、多糖、

6、多胺等的甲基化修饰“比如说,参与中核糖羟基和碱基上的氨基的甲基化,而的甲基化修饰也越来越受到关注“”。在对蛋白质甲基化修饰时,专门作用于肽链游离氨基上,而对小肽或氨基酸则无作用“。参与的甲基化反应为细胞膜提供磷脂,调节或维持某些酶活性,维持高激素以及神经递质(如多巴胺,褪黑素,血清素)的水平等“”。转硫作用在脱甲基后生成的腺苷高半胱氨酸经随后的代谢生成半胱氨酸,半胱氨酸又可代谢转交为(谷胱甘肽)。是体内硫储存库和细胞主要的抗氧化物质,在慢性肝病患者中,水平降低的部分原因就是合成减少所致。转氨丙基作用经脱羧后生成的腺苷甲基硫丙胺转氨丙基给腐胺或亚精胺则生成相应的亚精胺和精胺,这些都是真核生物中重

7、要的多胺,而一甲基硫腺苷是副产物嘲。在正常的条件下,此代谢途径在体内代谢中所占份额不超过,而在肝移植和早期肝癌患者中,则发现此代谢途径会被诱导加强“”。一腺苷甲硫氨酸在临床上的应用在临床上的应用主要表现在对肝病、关节炎、抑郁症、等有很好的疗效“”。大量的临床表明,在改善肝功能以及对于各种原因引起的肝功能异常都有很好的功用。比如说,对胆汁淤积、酒精肝造成的肝损伤、肝功能紊乱等都有疗效,尤其可以显著降低肝硬化的死亡率“删。可以提高脑内羟色胺和一羟吲哚乙酸的水平,对各种抑郁症,尤其是产后抑郁症有疗效。与其它抗抑郁症相比,具有见效快、无成瘾性、无不良反应、耐受性好等优点,在与标准抗抑郁药(如米安巴林、

8、丙咪嗪等)联合使用时比单独用药起效快】。关节炎患者在接受治疗两周后症状就能得到改善,其疗效与酮洛芬相当,但副作用却小得多,且见效快。此外,还有如下功用:增强不四川师范大学硕士毕业论文育男性的精子活力伽,有助于治疗偏头痛嘲、肌纤维痛和冠心病嘛堋,减轻脑震荡后遗症,治疗多发性硬化、帕金森氏病、亚急性脊髓交性以及引起的神经性并发症,并且还具有抗衰老、改善睡眠等多重功效渊。腺苷甲硫氨酸的获取方法的方法主要有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法等种。化学合成法化学合成最常用的方法是用甲基供体碘甲烷()甲基化一腺苷高半胱氨酸。但由于其产率低,反应产物又为(±)腺苷甲硫氨酸的混旋物,且难以分离得到

9、有活性的(一)构型产物等明显缺点,故而很少被实际应用。酶促转化法酶促转化法主要利用合成酶(,又称:。),催化底物卜甲硫氨酸和生成(一)型,且合成酶有三磷酸酶活性,使三磷酸分解为焦磷酸和磷酸,酶促反应如下式所示:“首先用从大鼠肝脏细胞中提取的合成酶催化合成,催化底物甲硫氨酸和合成出。随后又有人从大肠杆菌和酵母中分离合成酶。汹等从组织和曼中分离合成酶合成具有生物活性的;随着固定化技术的发展,固定化合成酶被用于合成阻蛳:”等利用基因工程手段,将合成酶克隆到()中表达,并利用从该工程茵中提取的酶合成。该法具有反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短以及无污染等优点,但是,合成酶在动植物和微生物体内含量

10、少,酶活不高,成本太高,且分离纯化困难,所以一般只用于合成同位素标记的啪捌。西川师范大学硕士毕业论文微生物发酵法某些微生物可以在细胞内积累,通过对这些微生物的发酵,尤其是在培养基中添加一定量的甲硫氨酸的情况下,可以获得大量的。因此通过微生物的发酵,再从中提取精制是目前工业生产的主要途径。从富含的面包酵母提取,但产物含量低,分离纯化困难,没法形成可行的生产工艺;啪通过筛选多株不同的菌株,分离到一株菌,该菌在发酵罐中培养天后的产量高达(菌体生物量达到)。这是目前从各种专利和期刊上所查到的最高产量。的分离纯化由图所示的一腺苷甲硫氨酸分子结构可知,中含有多个带电基团,这为它的分离纯化提供了一个很好的途

11、径一离子交换法。离子交换法简介离子交换法被广泛应用于物质的分离,主要对象为带有电荷、离子形式的物质。常利用离子交换填料的带电性与分离物亲电吸附,根据不同物质吸附强度的不同,从而达到洗脱分离的目的”。二十世纪年代,离子交换材料取得重要突破,各种离子交换材料相继出现并逐步发展,如大孔交联聚苯乙烯离子交换树脂、热再生树脂和鳌合树脂等新型材料,为离子交换法的应用开辟了广阔前景。二十世纪末,离子交换法第一次应用于生物物质的分离,从蛋白质水解液中分离氨基酸啪。近年来,离子交换法分离的对象也由简单的金属离子、小分子化合物扩展到大分子以及各种普遍的生物物质。离子交换材料的合成和离子交换法的应用技术互相推动,迅

12、速在工业、冶金、环保、生物、医药、食品等许多领域取得了巨大成功。离子交换树脂作为一种常用填料,是三元网状结构的高分子聚合物。它由三部分组成:不溶性的三维空间网络骨架,连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷的可交换离子”删。由功能基团所带的电荷的不同,可将其四川师范大学硕士毕业论文分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂:根据功能基团解离性的不同,可将离子交换树脂进一步划分为:强酸型阳离子交换树脂(出等)、弱酸型阳离子交换树脂(等)、强碱型阴离子交换树脂(,)。等)和弱碱型阴离子交换树脂(。)。可交换离子在骨架中进进出出,发生离子交换。离子交换过程可以看作是可逆多相化学反应。一般来说包括三个步

13、骤:外部扩散、内部扩散、化学交换。影响离子交换过程选择性的因素有很多,比如说,离子和材料阃的亲和力越大,越容易被吸附,越难洗脱,当吸附离子后,材料的膨胀度减小,亲和力加大。亲和力过大,不容易洗脱,而亲和力太小,则选择性差啪一。离子的化合价、溶液的酸碱度、树脂的交联度及膨胀度等对离子交换都有很大的影响。此外,有机溶剂对离子交换过程选择性也有影响,当有机溶剂存在时,对有机离子的选择性降低,易吸附无机离子。影响交换容量的因素主要有以下几点:交换基团的数目和性质,这是决定交换容量的根本因素。环境的酸碱度,它对强酸或强碱性材料的交换容量影响不大,而对弱酸或弱两性材料的影响大。溶液离子强度太高会与目的物竞

14、争,减少交换容量。有机溶剂,它会减弱材料对离子的吸附。离子交换法在棚分离中的应用除具有一个带正电荷的锍外,还有三个可离子化的基团:分别为,的氨基酸链上的羧基和氨基,为的嘌呤上的氨基。在酸性条件下带正电荷,能和阳离子交换树脂进行离子交换。因此,通过离子交换法,可与杂质分开。工在原来的基础上对洗脱流程进行了一些改进。先利用雷氏盐对的高氯酸提取液沉淀除杂质,再将除杂后的腺苷甲硫氨酸于可柱上经不同浓度的书。分段洗脱,并用磷钨酸和,、,进行先后沉淀,最终得到较纯的一腺苷甲硫氨酸。上利用一分离德到腺苷甲硫氨酸和腺苷同型半胱氨酸。刘惠等“报道利用苦味酸等结合有机试剂结晶沉淀方法来沉淀、分离,获得稳定、纯度较

15、高的硫酸盐。四川师范大学硕士毕业论文一腺苷甲硫氨酸的稳定性研究一腺苷甲硫氨酸是双手性物质,有种异构体:(,)一和(,)一。失活机理其中只有(,)一才具有生物活性的失活反应可按照以下种不同的机理进行“”。其一,也是最主要的失活反应。是通过氨基酸链上的羧基氧对一碳原子进行分子内亲核攻击,从而裂解形成,甲硫腺苷(。)和高丝氨酸()内酯,随后,内酯水解。其二,(,)一通过自发消旋变成非生物活性的(,)一,但其消旋机理尚未得到阐明。锍会通过自发的消旋作用失去手性,而锍的消旋与生成的非酶促水解是同时发生,彼此相互竞争的。生物体内的裂解反应和水解反应在某种程度上平衡了(,)一的消旋反应,从而防止了(,)一的

16、过量累积”“。其三,水解生成腺嘌呤()和一戊糖甲硫氨酸()。影响一腺苷甲硫氨酸稳定性的因素包括酸度、湿度、温度等。就酸度的影响而言,由于有多个可解离基团,因此值对其失活反应有着很大的影响,因此,总的来说,酸性条件可以减少的失活。另外,低温和保持干燥也有利于的稳定。盐的稳定性盐的稳定性关键取决于分子中的阴离子的性质,提高阴离子的立体障碍可增加其稳定性汹。大分子量的阴离子通过静电作用与结合,利用其空间位阻限制氨基酸链的自由旋转,从而使得的稳定性得到提高“剐。按照盐的溶解性,可将其分为下列两大类:水溶性聚阴离子盐和脂溶性多阴离子盐。,水溶性聚阴离子盐具有高度稳定性。通过与盐酸盐、对甲苯磺酸硫酸盐的热

17、稳定性比较实验发现,固态聚阴离子盐在时,能长期稳定存在,而在时的稳定性却各不相同,但它们在时的稳定性均远远高于盐酸盐和对甲苯磺酸硫酸盐。稳定、非水溶性盐,是由牛磺酸酞胺衍生物与碳原子数为的脂四川师蓖大学硕士毕业论文肪酸化学合成的具有高立体障碍的多阴离子盐。埘酰化油酰牛磺酸钠具有高度稳定性,在任何值下,其稳定性均表现得比硫酸盐样品要高:在室温下贮存于开口瓶中时,酰化油酰牛磺酸钠样品中的量在个月后只减少了,在个月后仍有的存在,而对甲苯磺酸硫酸盐个月就降低了:如若真空贮存或干燥剂(:魄)中贮存,酰化油酰牛磺酸钠样品中的腿量在个月屠仍为嘶。“。新型大阴离子盐不但大幅度提高了其稳定性,而且其生物利用率亦

18、有所提高,因此具有良好的应用前景。腺苷甲硫氨酸的市场需求情况早在年代末,作为临床处方药就已出现在欧洲医药市场上。当时是用作治疗关节炎的抗炎止痛药物。国外抗炎药物品种极多,而并未占有什么优势。年代中,在欧渊被推荐为抗忧郁症的精神病药物。年在美国通过了的随机双盲法验证。在国外,已应用的非常广泛。药用由德国基诺()药厂在世纪年代首先用于临床,目前已在意大利、德国、美国、西班牙、俄罗斯、法国和中国等国作为抗抑郁药、关节炎药和肝病药应用于临床。同时在食品添加剂中也有广泛应用。在年,在意大利作为抗抑郁处方药用量排名第三:年美国的和两家公司首次从欧洲进口,到年上半年,在公司全美各大药房销售总量排名第位;根据

19、统计的美国销售额数据,在年特殊营养补充品的销售额中名列第四。在国内的市场也非常广阔。我国是肝炎流行的大国,乙肝病毒携带者约亿,加上酒精和药物对肝损害的患者,人群更是巨大。而我国目前尚无一种能真正改善肝细胞代谢的生化药物。在人体内是由肝脏细胞合成的,而肝脏又是发挥其生物学作用的主要场所。在肝细胞功能有障碍时,必然会损伤到的生物合成和代谢作用,因此,应该是肝病治疗的理想药物。据报道,不仅有利于各种急、慢性肝病的治疗,而且对实验性动物早期肝癌也有预防作用。此外,我国各类关节炎患者达到亿,抑郁症患者四川师范大学硕士毕业论文万,随着生活节奏的加快和工作压力的增加,抑郁症患者也明显增多。据估算,我国的年用

20、量应在吨左右。此外,在保健和化妆品行业也有很大的应用前景。作为生化试剂,在国内早已有商品供应。目前,在国内销售的只有德国基诺药厂生产的“思美泰”,作为肝病治疗药物,在国内销售价格昂贵。据年网上最新报价,片剂每日最大服用单价约为元,粉针剂约为元。由此可见,临床推广应用的关键在于降低其生产成本。一腺苷甲硫氨酸的研究背景。对实验室保藏的株不同类型的菌进行含量检测后发现,相对其余种细菌,只有有较高的含量。,嘲在对余株菌株胞内含量的检测后发现,胞内含量高于的菌株只出现在酵母菌中,其中余株胞内含量超过;而担子菌、霉菌、细菌、放线菌、乳酸菌等其余类菌株的胞内含量均低于。因此,在他们之后的研究都主要集中在对酵

21、母菌的研究上,以期获得产量的提高。迄今为止,通过诱变方式来有效提高酵母菌中产量的报道相对较少。通过对诱变处理和制霉菌素抗性筛选,分离得到麦角固醇合成缺陷型突变菌株,这些突变株可以通过减少的消耗量从而达到在菌体内富集的目的。由该结果可以推知,对其它酵母菌进行制霉菌素抗性筛选,可能也会筛选到高产菌株。此外,上酬通过乙硫氨酸的抗性筛选,也分离得到一株富集的乳糖利用型突变菌株(。最近,董函竹“”等对诱变选育的酿酒酵母产生的摇瓶发酵条件进行了优化,产量可达;陈小龙嘞等人对土壤中筛选到的酵母菌培养条件进行了优化,产量最高达;申丽”等人对重组的厅曲妇摇瓶发酵天后,产量可达(干细胞),这是目前国内报道的最高摇

22、瓶产量。嘲对分离到的在发酵罐中培养天后,产量高达(菌体生物量达到),四【师范大学硕士毕业论文这也是目前报道的最高产量。目前国内尚未实现规模化生产,开展利用多种不同来源的微生物有效生产的研究是十分必要的。本研究先从自然界中分离到株高产菌株,对其进行多轮复合诱变筛选。最后,对筛选获得的株高产突变株进行摇瓶优化培养研究,为下一步的研究打下坚实基础。四川师范大学硕士毕业论文第二章一腺苷甲硫氨酸高产菌株的筛选及诱变育种摘要利用分离培养基从采集到的个各种不同来源样品中分离得到株酵母菌菌株。通过对该株酵母菌菌株进行纸层析法初筛和法复筛,获得株一腺昔甲硫氨酸高产株¥,其产量为。通过对菌株¥的亚硝基胍()诱变和

23、乙硫氨酸抗性筛选,分离到抗性菌株株,其中突变菌株的胞内含量为,较菌株¥提高了倍。突变菌株经亚硝基胍诱变和低浓度(¨)制霉菌素的抗性筛选,获得制霉菌素抗性菌株株,其中突变菌株一的胞内含量为。突变菌株一再经紫外()诱变和高浓度(崛)制霉菌素的抗性筛选,分离得到抗性菌株株,其中突变菌株一胞内含量为,较出发菌株一提高了。关键词:腺苷甲硫氨酸酵母菌筛选诱变,¥(),¥一(),一()匹师范大学硕士毕业论文一。一一一,肛、卜魁:一():;引言一腺苷甲硫氨酸(。简称为)是一种广泛存在于生物体内的重要生理活性物质,作为甲蓦供体参与了体内许多生物化学反应,涉及到核酸、蛋白质、磷脂、多糖、多胺等的合成。参

24、与的甲基化反应为细胞膜提供磷脂,调节或维持某些酶活性,维持高激素以及神经递质(如多巴胺,褪黑素。血清素)的水平等“。在临床上,已作为处方药物用于治疗抑郁症、关节炎、肝功能紊乱等嘲。在保健和化妆品行业也有很大的应用前景。但由于价格昂贵,国内尚未实现规模化生产,因此很有必要对提高产量进行研究。倘的方法主要有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法等种化学合成由于其产率低,反应产物为(±)腺苷甲硫氨酸的混旋物,且难以分离得到有活性的()构型产物,故而很少被实际应用踟。酶促转化法具有反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短以及无污染等优点,但是,合成酶在动植物和微生物体内含量少,酶活不高,成本太

25、高,且分离纯化困难,所以一般只用于合成同位素标记的峨“。某些微生物可以在细胞内积累,通过对这些微生物的发酵,尤其是在培养基中添加一定量的甲硫氨酸的情况下。可以获得大量的,因此通过微生物的发酵,再从中提取精制是目前工业生产的主要途径。嘲对实验室保藏的株不同类型的菌进行含量检测后发现,四川师范大学硕士毕业论文相对其余种细菌,只有有较高的含量。嘲在对余株菌株胞内含量的检测后发现,胞内含量高于的菌株只出现在酵母菌中,其中余株胞内含量超过;而担子菌、霉菌、细菌、放线菌、乳酸菌等其余类菌株的胞内含量均低于。因此,在他们之后的研究都主要集中在对酵母菌的研究上,以期获得产量的提高。迄今为止,通过诱变方式来有效

26、提高酵母菌中产量的报道相对较少。“”通过对诱变处理和制霉菌素抗性筛选,分离得到麦角固醇合成缺陷型突变菌株,这些突变株可以通过减少的消耗量从而达到在菌体内富集的目的。由该结果可以推知,对其它酵母菌进行制霉菌素抗性筛选,可能也会筛选到高产菌株。此外。口以嘲通过乙硫氨酸的抗性筛选,也分离得到一株富集的乳糖利用型突变菌株。因此,开展利用多种不同来源的微生物有效生产的研究是十分必要的。材料样品来源样品分别从四川师范大学校园区、成都市周边区县农田、菜地、果园、污水沟、乳品厂、污水处理厂等处采集获得,并对采集到的样品当天采集当天分离。主要设备恒温培养箱、恒温震荡摇床、磁力搅拌器、恒温水浴锅、分光光度计、岛津

27、()一分光光度计、微量电子天平、分析天平、酸度计、无菌操作台、紫外诱变箱(自制,紫外灯管,波长)、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、高效液相色谱岛津()型。培养基()完全培养基():酵母粉,蛋白胨,葡萄糖:自来水配四舜蓖大学硕士毕业论文制,自然。(固体培养基另加琼脂)()酵母菌分离培养基():葡萄糖。酵母粉,尿素,。,卿吼,()。,嘎。,琼脂;。,虎红(水溶液)()豆芽汁培养基():葡萄糖,琼脂,豆芽汁(称取豆芽于水中煮沸后用四层纱布过滤,取滤液),定容至。()计数培养基:在完全培养基中加入虎红(每升培养基中加入虎红溶液)配制而成。()抗性筛选培养基:根据需要在完全培养基中加入适当浓度的一乙硫氨酸(

28、)或制霉菌素()。()发酵培养基鼬():葡萄糖,酵母粉,蛋白胨,甲硫氨酸;自来水配制,自然。主要药品及耗材葡萄糖、尿素、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、琼脂、硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、无水乙醇、冰乙酸、丙酮、高氯酸、盐酸等药品均为国产分析纯试剂;一甲硫氨酸(进口分装):胰蛋白胨(公司)、酵母粉(公司);乙硫氨酸(公司);制霉菌素(公司);腺苷甲硫氨酸标品()(公司);亚硝基胍(日本东京化成工业株式会社);新华一号层析滤纸。主要试剂()生理盐水:称取氯化钠溶于双蒸水中,。灭菌备用。()柠檬酸缓冲液:柠檬酸钠,柠檬酸溶于双蒸水中,于灭菌备用。()亚硝基胍()母液:称取溶于丙酮中

29、,加入柠檬酸缓冲液,配制成浓度为的母液。()纸层析展开液嘲:正丁醇:乙酸:水:。()印洗脱液嘲:甲酸铵一甲酸缓冲溶液,。,四川师范大学硕士毕业论文()醇碱液:,乙醇方法亚硝基胍诱变处理取生长对数期菌液于、离心,用生理盐水洗涤次,再用柠檬酸缓冲液洗涤次并悬浮菌体于此缓冲液中,调节菌体浓度至个左右。加入亚硝基胍母液至终浓度“,于。避光处理一段时间后加入生理盐水稀释终止反应。用生理盐水洗涤次,悬浮菌体于生理盐水中。取涂布抗性平皿,平皿置于避光培养天。紫外线诱变处理取生长对数期菌液于、离心,用生理盐水洗涤次,再用生理盐水悬浮菌体并调节菌体浓度至×个左右。吸取菌悬液于直径的无菌平皿中,将平皿置

30、于磁力搅拌器上,在紫外灯(距离)下搅拌照射一段时间。分两组涂布抗性平皿,一组直接稀释后取涂布平皿;另一组则经液体培养基活化过夜(避光,)后稀释,取涂布平皿。抗性平皿置于避光培养天。诱变流程出发菌株竖透童丝垄乙硫氨酸抗性平皿分离筛选获得产量提高的突变菌株坚透变丝§低浓度制霉菌素平皿初筛获得产量进一步提高的突变菌株盟透銮丝墨高浓度制霉菌素平皿复筛获褥高产变异菌株含量的测定取发酵菌液离心、无菌水洗涤后,加入儿高氯酸混匀纸层析法后于室温下静置,离心,取此上清液于新华滤纸上点样、层析。”。吹四川师范大学硕士毕业论文干层析滤纸,于册紫外灯下标记出的位置,剪切回收。用盐酸洗涤回收滤纸,洗涤液于测定

31、紫外吸收值。最后,根据标准曲线计算出含量。法取发酵菌液离心洗涤后,用无菌水悬浮菌体,加入高氯酸混匀后于室温下静置。、离。,上清液转管并加入和,离心,取虬上清液上柱(。柱)渊。洗脱液流速为菌体生物量的测定取发酵菌液于条件下离一,用无菌蒸馏水洗涤菌体,于烘干后称重。由烘干前后的重量差计算生物量。诱变剂致死率的计算将诱变和未经诱变的菌液分别稀释涂布于计数培养基平皿上,于条件下培养后计数。诱变菌株在平皿上长出的菌落数×诱变剂致死率同梯度下未诱变菌株在平皿上长出的菌落数菌体麦角固醇的提取及其含量测定取发酵液,离,弃上清液,沉淀用无菌水洗涤次后转入三角瓶中,加入醇碱液,于水浴中皂化中途振荡次。冷

32、却至室温后加入石油醚,振荡后静置,取上层石油醚在姗处测定紫外吸收值隗剐。总麦角固醇含量(嚣。)细胞生物量()一脱氢麦角固醇含量(。)细胞生物量麦角固醇含量总麦角固醇含量()一脱氢麦角固醇含量”注:公式中的,分别为麦角固醇,()一脱氢麦角固醇的(。)四川师范大学硕士毕业论文值;为样品量×稀释倍数。结果与讨论一腺苷甲硫氨酸高产菌株的筛选精确称取腺苷甲硫氨酸标品左右于中,定容至纸层析法标准曲线的绘制制成母液,用梯度稀释成三组标液(表)。分别测定各标液在处的紫外吸收值,以吸光值为纵轴,标液浓度为横轴绘制腺苷甲硫氨酸标准曲线(图)。表标液浓度样号浓度()¨¨飘耵纸卯札弘她掘

33、觚纸岳鳃!耋墨“¨号号号号号号号号号号号陇由图可知,标线的回归方程为:(方程中的为浓度,单位;为值);相关因子为:。酵母菌菌株的分离将采集到的个样品中的固体样品分别称取置于生理盐水中,经玻璃珠振荡打散后梯度稀释,取虬涂布于酵母菌分离培养基、豆芽汁培养基上,置于培养天。对于液体样品则直接梯度稀释,取儿涂布于酵母菌分离培养基、豆芽汁培养基上。对获得的菌株分别进行光学显微镜镜检、菌落培养特征分析,最终分离得到株酵母菌,保藏于斜面上。捌昌譬标渍浓度(,)图腺苷甲硫氨酸标准曲线腺苷甲硫氨酸高产菌株的筛选株酵母菌分别经活化后,转种于发酵培养基中振动培养,培养基装液量为每三角瓶装发酵培养基。发酵液

34、经纸层析法初筛和法复筛,检测出菌株胞内含量。各酵母菌菌株含量的筛选结果如表所示。由表可知,在所有测定的株酵母菌中,株酵母菌菌株胞内含量为,占所有被测菌株的。株酵母菌菌株胞内含量低于,约占所测菌株的。由测定结果可知,在测定酵母菌菌株中,不同菌株胞内的积累水平在较大的范围内波动,且绝大多数酵母菌胞内的含量都不太高。经迸一步的检测。发现株被命名为的酵母菌菌株胞内积累量最高,其单位体积含量为,单位菌体含量是,菌体生物量为。¥菌株含量相对较高,故选择菌株作为诱变出发菌株。该菌株由采集自乳品厂的淤泥样品中分离获得,经生理生化鉴定以及和分子鉴定,发现酵母菌菌株¥属于热带假丝酵母()(菌种鉴定的具体过程略,其

35、细胞形态见图)。表各酵母菌胞内含量调查嘲对实验室保藏的株不同类型的菌进行含量检测后发现,相对其余种细菌,只有有较高的含量。“口朝在对余株菌株胞内含量的检测后发现,胞内含量高于的菌株只出现在酵母菌中,其中胞内含量最高的是一组。此外,通过乙硫氨酸的抗性筛选,也分离得到一株富集的乳糖利用型突变菌株。而用其他种类菌株高产的报道相对较少。本研究发现,热带假丝酵母()的胞内含量也相对较高,这为以后的研究提供了更多的可选菌种。四川师范大学硕士毕业论文图菌株¥的显徽照片()¥(×)一腺苷甲硫氨酸高产菌株的诱变选育乙硫氨酸抗性菌株的筛选乙硫氨酸抗性菌株的初筛为了确定原始菌株¥对乙硫氨酸的抗性水平,分别将其涂布于含有,和一乙硫氨酸的抗性筛选固体培养基上。与多

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