内毒素体外诱导大鼠肝细胞凋亡

1、    内毒素体外诱导大鼠肝细胞凋亡        【摘要】目的探讨内毒素在体外直接作用于大鼠肝细胞时，肝细胞所发生的病理及生物化学特性的变化。方法采用胶原酶灌注法分离肝细胞，体外培养后在培养基中直接加入内毒素，用光镜和透射电镜观察其形态学变化；提取肝细胞的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳观察肝细胞生物化学性质的改变。结果内毒素直接作用的肝细胞在形态学上表现出染色质凝集等凋亡细胞的特征；在生物化学方面表现典型的凋亡梯形，此过程可以被凋亡抑制剂金红三羧酸(aurintricarbox

2、ylic acid, ATA)抑制。肝细胞凋亡的数量随内毒素剂量的增加而增加，并且在处理前24小时之内随处理时间的延长而增加。结论内毒素在体外直接作用于肝细胞，可诱导肝细胞发生凋亡。【关键词】内毒素脂多糖凋亡肝细胞Lipopolysaccharide-induced apoptosis of rat hepatocyte in vitroLIANG Xiubin, QIAO Zhongdong, YIN Lei, et al.Shanxi Medical University, Division of Pathophysiology, Taiyuan 030001【Abstract】 Obje

3、ctives To investigate the effect of lipopolysaccharide(LPS) on hepatocyte in vitro. Medthods The hepatocytes were isolated in the way of liver perfusion with 0.05% collagenase type I and type , and cultured for 24h in vitro before LPS was added directly into the culturing medium. Propidium iodide(PI

4、) staining, and transmission electron microscopy techniques had been used to observe the morphological changes of hepatocyte treated with LPS. DNA-fragment assay was analyzed by the agarose gel electrophoresis to determine apoptostic level. Results Hepatocytes incubated with LPS exhibited some typic

5、al apoptosis-specific morphological features. The DNA-fragment by agarose gel electrophoresis demonstrated the typical ladder pattern on the hepatocytes directly exposed to LPS, but it was absent in the group used ATA, an inhibitor of apoptosis. These morphological changes, accompanied by DNA fragme

6、ntation assay, confirmed that cells were dying through an apoptotic pathway. In addition, the hepatocyte number of apoptosis increased parallel with the dose of LPS and time within 24h when hepatocytes were exposed to LPS alone. Conclusions LPS can induce apoptosis of hepatocyte in vitro.【Key words】

7、 Endotoxin Lipopolysaccharide Apoptosis Hepatocyte内毒素是革兰氏阴性细菌荚膜的脂多糖(lipo-polysaccharide, LPS)。在内毒素直接作用下，肝细胞将发生什么样的变化？它对肝细胞是毒性作用还是其它作用，目前尚不清楚。我们观察了内毒素在体外的直接作用下，肝细胞所发生的变化。材料与方法1.实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重200g，山西医科大学实验动物中心提供。2.肝细胞的分离和培养：采用Seglen1法分离肝细胞。肝细胞悬液的密度为2×105/ml。37体积分数5%CO2条件下培养24小时。用台盼蓝染色法显示细胞活性

8、，本实验中培养的细胞活性均在90%以上。3.肝细胞的处理：将肝细胞培养24小时后，分以下几组：剂量系列组肝细胞分别以5mg/L, 10mg/L, 20mg/L, 40mg/L四种不同浓度的LPS处理，时间均为20小时；时间系列组肝细胞均用10mg/L的LPS处理，并分别在3小时,6小时,12小时,24小时等四个时间点收集肝细胞；LPS+ATA组中LPS的剂量均为10mg/L, ATA为100mol/L，均作用20小时。上述各处理组都同时设不作任何处理的正常对照组。4.碘化丙锭(PI)染色：用细胞刮勺将培养好的细胞(2×106)刮起，转移至离心管中，离心弃上清液，PBS漂洗后，固定于体

9、积分数70%的乙醇中，再经离心漂洗，重悬于4mlPI染液中，置4避光染色30分钟后，涂片在荧光显微镜下观察。5.透射电镜观察：肝细胞同上收获后，转移至离心管中，离心弃上清液，用PBS漂洗，2%戊二醛(pH7.4)固定，经1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1%四氧化锇固定，丙酮系列脱水，环氧树脂包埋后，样品切片经染色载于铜网上，在透射电镜下观察。6.DNA片段的提取：采用Moore等2方法提取培养细胞的DNA片段。提取片段经空气干燥后溶于20l的双蒸水中，4保存备用。结果1.肝细胞形态学的变化：用PI对LPS处理组肝细胞及正常组肝细胞染色后，荧光显微镜下可见经LPS处理后肝细胞细胞体积缩小、细胞

10、核出现凹沟，有的细胞核分裂成数个小核，而正常细胞核为圆型，周边整齐光滑，符合细胞凋亡的光镜特征。透射电镜下经LPS处理后，肝细胞的细胞核电子密度较高，染色质固缩，聚集于核膜，呈境界分明的块状或新月状小体，有的细胞凹入细胞内，将细胞器包裹形成所谓的凋亡小体，与细胞凋亡的特征相符。2.肝细胞生物学特性的变化：在培养基中加入了LPS(10mg/L)以后明显可见是梯形分布的DNA条带；再加入ATA后，梯形分布的DNA条带的亮度与正常对照组接近，说明LPS可以诱导细胞凋亡，且又可以被ATA抑制。在培养基分别加入0mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L LPS，并处理20小时，当没

11、有LPS时，不出现凋亡梯形，而其它四个剂量组却随着LPS剂量的增高，凋亡梯形的亮度也增高。凋亡的肝细胞数量随培养基中LPS的剂量增加而增加(1)。1.Markers,2.Control,3.LPS5mg/L,4.LPS10mg/L,5.LPS20mg/L,6.LPS40mg/L1不同剂量的对LPS肝细胞凋亡的影响当恒定了LPS的剂量(10mg/L)以后，分别在0小时,3小时,6小时,12小时和24小时进行观察，结果发现在24小时之内肝细胞随LPS作用时间的延长凋亡细胞的数量也在增加，而且在LPS作用肝细胞3小时就表现出明显的凋亡梯形，在LPS作用肝细胞的早期就可以有细胞凋亡的发生(2)。1.M

12、arkers,2.Control,3.LPS3h,4.LPS6h,5.LPS12h,6.LPS242LPS在不同处理时间对肝细胞调亡的影响讨论在LPS的直接作用下，肝细胞在形态学上表现出典型的细胞凋亡特征；在生物化学方面，也表现出典型的凋亡梯形。而且这一过程可以被凋亡抑制剂ATA所抑制。肝细胞凋亡的数量与LPS的剂量成正比；在用LPS处理24小时之内肝细胞凋亡的数量也与时间成正比。这说明LPS可以直接诱导肝细胞凋亡，且此作用在处理早期明显。Leist等3证实了无论是用LPS还是肿瘤坏死因子处理半乳糖胺（或放线菌素D）致敏鼠造成的肝损伤早期均表现为凋亡特征，晚期则凋亡和广泛的细胞坏死同时发生。当

13、在电镜下观察到凋亡小体时，血清中转氨酶水平还未见升高，说明在肝损伤时，早期发生细胞凋亡，晚期为细胞坏死。我们的实验结果进一步证实了这一观点。本课题受山西省归国留学人员启动基金资助作者简介：梁秀彬女，27岁，硕士，主治医师。作者单位：梁秀彬乔中东尹镭赵嘉惠（030001太原，山西医科大学分子生物学实验室）；韩德五（病理生理学教研室）参考文献1 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol, 1976, 13: 79-83.2 Moore KJ, Matlashewski G. Intracellular infection by leishmania-donovani inhibits macrophage apoptosis. J Immunol, 1994, 152: 2930.3 Leist M, Gantner F