缺血性损伤对大鼠心肌生物膜的影响及益心康胶囊的保护作用

1、中药药理与临床2000;16(62方法和结果211对S 180肉瘤鼠T 淋巴细胞酯酶染色率的影响取S 180肉25表2蜂毒对S 180肉瘤鼠网状内皮系统碳粒廓清能力的影响(x ±s 组别剂量(动物数( 10101010K 值2333164±1815545190±1219452150±1812632120±121903值3172±11284120±01925183±113333瘤株接种于小鼠腹腔内,012ml/鼠,7天后, 将肉瘤鼠断头放血后, 放在瓷盘上, 消毒腹部, 用无菌针筒抽取腹部腹水, 以生理盐水13稀释,

2、 接种于小鼠腋窝皮下012ml/鼠, 第2天, 将肉瘤鼠随机分4组, 每组12只。腹腔给药015ml/20g , 连续5天, 末次给药后2h , 于各鼠眼眶静脉丛取血, 采置到干净玻片上, 迅速推成均匀血涂片, 将片子自然干燥, 浸入到已预热30min 的孵育液中孵育3h , 取出用自来水冲洗3min , 自然放干, 将涂片置复染液中, 染片15min , 取出, 自来水冲洗, 滤纸吸干, 镜检, 计数100个淋巴细胞, 观察ANAE 阳性淋巴细胞, 计算阳性淋巴细胞染色率, 结果见表1。表1蜂毒对S 180肉瘤鼠T (x ±s 对照蜂毒蜂毒52Fu 3P <0. 050163

3、013247211法, 抽取S 18013稀释, 接种于2226g 雄性小鼠腋窝皮下012ml/, 天, 将肉瘤鼠随机分为4组, 每/鼠, 连续给药4天(分组与只, 11 , 以10%SRBC 20/只鼠注入小鼠20h 后, 测厚仪测量小鼠足厚度, 计算差值作, 结果见表3。表3蜂毒对SRBC 诱发S 180肉瘤鼠足垫DTH 反应的影响组别剂量(动物数( 10101010足肿胀度( 0118±01040116±01070115±01040111±0105组别对照蜂毒蜂毒52Fu剂量( 10101010E 3212±41915214±8

4、1484612±111085212±13186P 值t 值P 值0163013247615231714126<0. 01<0. 01<0. 01对照蜂毒蜂毒52Fu0163013247<0. 05结果所示, 蜂毒二个剂量组均可明显增加S 180肉瘤鼠T 淋巴细胞酯酶阳性染色率。212对S 180肉瘤鼠血液中惰性碳粒廓清能力的影响按211法将肉瘤鼠随机分为4组, 每组12只, 连续给药5天, 末次给药后24h , 于鼠尾静脉注入稀释墨汁(14 011ml/10g 鼠重, 注入墨汁后2min 、12min 分别用毛细管于小鼠眼眶后静脉丛取血25l ,立即

5、放入 2ml 0. 1%Na 2CO 3溶液中, 取正常小鼠血溶于2ml 0. 1%Na2CO 3溶液中校零, 于分光光度计675nm 处测OD 值, 取肝、脾称重, 结果见表2。结果所示:蜂毒在0132mg/kg 剂量组可显著增强S 180肉瘤鼠RES 吞噬功能, K 值和值均见明显增高。213蜂毒对SRBC 诱发S 180肉瘤鼠足DTH 反应的影响按结果所示, 蜂毒两个剂量组对S 180肉瘤鼠DTH 反应未显示明显影响。3讨论本文结果表明, 蜂毒0132mg/kg 、0163mg/kg 能增加T 淋巴细胞酯酶阳性染色率, 表明具有增强T 淋巴细胞功能的作用。光镜下中性粒细胞数目相对多于T

6、淋巴细胞数目, 可能与S 180肉瘤鼠引起炎性渗出增多致腹水有关。蜂毒0132mg/kg 能增强S 180肉瘤鼠RES 对碳粒廓清能力, 具有增强RES 单核巨噬细胞的吞噬功能作用。蜂毒对SRBC 诱发足垫DTH 反应未能显示明显增强的作用。综上所述, 蜂毒用于抗肿瘤治疗, 其机理可能与增强RES 的吞噬功能和增强细胞免疫功能有关。缺血性损伤对大鼠心肌生物膜的影响及益心康胶囊的保护作用韩玲陈可冀11(军事医学科学院放射医学研究所北京100850, 中国中医研究院西苑医院北京100091观察了异丙肾上腺素(ISO 对大鼠心肌生物膜的损伤作用, 评价了益心康胶囊对心肌生物膜2线粒体和肌纤维膜的提要

7、保护作用。关键词异丙肾上腺素; 线粒体; 肌纤维膜; 益心康胶囊; 磷脂; 磷脂酶A 2; 游离脂肪酸; 膜脂流动性已有研究表明, 心肌生物膜损伤是心肌细胞由可逆性损伤转化为不可逆性损伤的早期特定和重要标志。本实验观察了异丙肾上腺素损伤大鼠心肌模型心肌生物膜2线粒体及肌纤维膜的损伤作用及益气活血中药复方益心康胶囊对上述损伤导致的心肌肌纤维膜和线粒体膜结构及功能损伤的保护作用。H303, 上海药物研究所制药厂生产, 批号9506303, 棕色粉末状物,014g/粒, 实验时用水溶解配成50mg/ml 浓度。112动物Wistar 大鼠, 雄性, 体重250280g 。由军事医学科学院动物中心提供

8、。113试剂DPH 为Sigma 产品。CP K 、LDH 、胆固醇试剂盒:1材料和方法111试验药物益心康胶囊由丹参、川芎、黄芪等组成, 简称中生公司产品; 磷脂测定试剂盒:德国Bavaria 公司产品。114仪器GF 21型控时调速式高速分散器(江苏 ,CR21型高26中药药理与临床2000;16(6量H303组, 可显著降低线粒体和血清MDA 含量, 见表1。表1H303对ISO 损伤大鼠线粒体及血清MDA 水平的影响(x ±s,n =7速冷冻离心机(日立 , TLL 2C 型台式高速冷冻离心机(北京 ,F 24000型荧光分光光度计(日立 。115异丙肾上腺素ISO 致在体大

9、鼠心肌损伤模型1大鼠背部皮下注射ISO 5mg/kg ,24h 后再重复注射相同剂量, 第二次注射后60分钟处死动物后取血,4离心, 血清-20保存, 待测LDH 、CPK 、MDA 。另取011ml 血浆测LDH 。取200mg 左室, 制备心肌线粒体2及心肌肌纤维膜3, 测MDA 、膜脂流动性。线粒体脂质过氧化产物用微量测定法4。线粒体膜磷脂酶A 2(PLA 2 活性测定5。线粒体膜磷脂(PL 及胆固醇(CHO 的测定。PL 的测定, 磷脂测定试剂盒, 按trinder 酶法。CHO 测定, 应用中生生物工程高技术公司生产的试剂盒,CHOD 2PAP 法测定。游离脂肪酸(FFA 的测定6。

10、膜脂流动性(L FU 的测定7, 应用DPH 探针, 在荧光分光光度仪上测定。116分组及给药随机分为(1 ; (2 伤组(ISO ; (3 H303大剂量组(小剂量组(H 2S 50mg/kg 。每组7天开始灌胃给药,2次/日, 连续7天。6天起sc ISO 造型。117统计学方法数据统计采用美国Sigmaplot 程序进行t 检验。表示为均数±标准差,P <0. 05, 具有统计学差异。组别对照损伤H303H303剂量(线粒体MDA ( 16129±6198102138±4613633#血清MDA ( 96125±8114183115±

11、;261233123133±141553333#3#1005025101±11194#3与对照组比3P <0. 05, P <0. 01;<0. 01(下同21ISO 损伤大鼠血中CP K组分别升高了33%和56%。H303可显著损伤所致的CP K 和LDH 水平的升高, 见表2。表2H303对ISO 损伤大鼠血清酶水平的影响(x ±s ,n =7 组别对照损伤H303H30310050剂量(mg/kg LDH (U/L 157167±53178358175±92102210189±8814833#CP K (U/L

12、 631124±206111943157±2931743841172±210148685196±167184#195167±67174#2结果211H303对大鼠心肌组织脂质过氧化的影响ISO 损伤大鼠213H303对线粒体磷脂酶A 2活性的影响ISO 损伤大鼠心心肌可导致心肌线粒体及血清MDA 含量异常升高, 尤以心肌线粒体升高为著, 分别较正常CON 升高了48%、84%, 两个剂表3组别对照损伤H303H30310050肌线粒体PLA 2活性显著升高。预防性给予H303, 可明显抑制PLA 2活性的升高, 见表3。H303对ISO 大鼠心

13、肌线粒PLA 2、PL 、CHO 及PL/CHO 比值的影响(x ±s 剂量(mg/kg PLA 2( 92184±5143126140±814633#PL (mol/mg pro 245195±65191165171±2912733#CHO (mol/mg pro 11745±0150511784±0137211957±0133811857±01330PL/CHO141182±1319794116±1310133#110157±8199#231120±28129#

14、120107±17185333与CON 组比较3P <0. 05, 33P <0. 01; 与ISO 组比较#P <0. 05, #P <0. 01214H303对大鼠心肌线粒体PL/CHO 的影响表3结果表CON 组增加了54%; 微粘度增加约58%, 因此导致线粒体膜明,ISO 损伤组线粒体膜PL 总量显著降低, H 2L 和H 2S 组可明显提高线粒体膜PL 含量对CHO 含量, 无显著影响。损伤组可见PL/CHO 比值比正常CON 组降低了34%。H303对PL/CHO 的降低均具有一定的改善作用。215H303对大鼠心肌线粒体和肌纤维膜游离脂肪酸的影

15、响ISO 损伤可致大鼠心肌线粒体、心肌肌纤维膜及血清中的FFA 含量及水平明显升高。给予H303后可明显降低FFA 的升高, 大剂量组也可显著降低线粒体及肌纤维膜的FFA 含量, 小剂量组仅可使肌纤维膜的FFA 显著降低, 对线粒体的FFA 含量增高无显著性降低作用, 见表4。表4H303对ISO 大鼠血清、心肌线粒体及肌纤维膜游离脂肪酸的影响(x ±s ,n =7组别对照损伤H303H303剂量(mg/脂流动性L FU 显著降低。H303可明显改善其流动性的降低。大鼠心肌肌纤维膜的膜脂流动性变化与上述相同, ISO 可值增高,L FU 显著降低。H303预防性致心肌纤维膜的P 值、

16、给药后可使其改善, 见表5。表5H303对ISO 大鼠心肌线粒体及肌纤维膜脂流动性(L FU 的影响(x ±s ,n =7组别对照线损伤粒体H -LH -S 对照肌纤损伤维H -L 膜H -S剂量(荧光偏振度( 01116±0100301138±010053301124±01004333301180±0101801277±010303301221±010323#微粘度( 01672±0102301857±0104633膜脂流动性( 2818±1181911±116332417±

17、;11933331012±217311±01933612±2173#15#01735#±010343#311299±0121111917±0153133#3#血清FFA (Eq/ 71177±12123Eq/mg FFA (pro 线粒体33131±1716#31164±0196533#肌纤维膜199134±140184#33333141124±2913333159167±9519133419141 ±19614231005085177±915438013

18、6±712747123±43175#242132±126174#138147±4211933223144±118133#3讨论本研究表明ISO 确可致心肌严重损伤, 表现为:脂质过氧化产物增多, 线粒体及血中MDA 水平异常增高; 心肌组织损216H303对大鼠心肌线粒体、肌纤维膜膜脂流动性的影响大鼠ISO 损伤后线粒体膜脂中的DPH 探针的荧光偏振度P 比中药药理与临床2000;16(6伤, 酶漏出增加, 血中CP K 及LDH 水平增高; 线粒体磷脂酶A 2激活, 继而导致线粒体膜PL 含量减少, 分解产物FFA 增加, 并造成线粒体膜、肌

19、纤维膜L FU 降低。H303为抗心肌缺血及再灌注损伤的中药复方8,9。本实验发现预防性给予H303可通过如下途径发挥其抗心肌缺血作用。311减轻生物膜的脂质过氧化程度本研究表明, ISO 损伤可导致大鼠体内或线粒体脂质过氧化水平明显增高, 导致了生物膜损伤。H303可使因ISO 所致的线粒体膜的脂质过氧化程度减轻, 从而发挥其抗损伤作用。312抑制PLA 2的激活, 减轻PL 的分解及FFA 的增加实验结果表明,ISO 损伤可导致膜PL 含量降低, FFA 含量增加, 说明是因PLA 2的激活所产生的结果。PL 降解产生的FFA 和溶血磷脂均可对膜脂产生去垢样作用, 坏。此外,ISO 属儿茶

20、酚胺类物质, FFA 水平的增高, 故在ISO 高。FFA 抑制作用, 因而使得A TP , 而导致氧化磷酸化脱偶联, 使ADP/O 降低, 影响线粒体呼吸功能。FFA 中的花生四烯酸还可经环氧化酶和脂氧化酶途径, 在分解产生脂介质的过程中形成自由基, 从而进一步加重心肌损伤10。H303可明显降低ISO 损伤所致的PLA 2活性的增高, 并使膜磷脂的降解减少,FFA 的生成减少, 说明H303可通过抑制氧自由基的产生或抑制自由基或增加内源性抗氧化能力等作用而发挥其心肌保护作用。313阻止生物膜脂流动性的降低本文结果, ISO 模型大鼠心 均显著增加, 肌线粒体及肌纤维膜荧光偏振度(P 及微粘

21、度(表明膜脂流动性降低。而H303可有效地抑制ISO 损伤后的膜脂流动性的降低。其可能机制为:(1 H303通过抑制ISO 损伤27后的脂质过氧化而减少MDA 进入膜脂双层结构的水相与膜蛋白、膜脂上的NH 2交联形成Shiff s 碱而降低的膜脂流动性; (2 H303通过降低PLA 2的激活而减少膜磷脂的降解, 使膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸增加, 来维持其膜脂流动性。参考文献1Sanchez VC. Sequential changes of energy metabolism and mitochondrial function in myocardial infarciton induc

22、ed by isoproterenol in rats :a long 2term and integrative study. Can J Pharmacol ,1997;75130013112Zydowo MM , G , et al. The respiration and cal 2of rats with vitamin 2D 2induced car 2155161Dk , K arlimer TS. Refined membrane preparations fall in myodardial 2receptor density. Am J Physicol ,1989; 25

23、7(3pt2 H1032H10364孙士勇, 徐波, 李秋菊, 等1在96孔板上进行脂质过氧化的微量测定1生物化学与生物物理进展,1995;22(2 1651695陈思锋, 吴中立1体液和组织磷脂酶A 2简便快速测定法1第二军医大学学报,1989;10(3 2542566李龙官1临床生化检验1上海科学技术出版社,19791687Lin KC , Nie SQ , Bo H J et al. Research on membrane fluidity of ascites cells with fluorescence probe DPH. Biochem Biophys ,1981;63134

24、8韩玲, 任建平, 杨素娟, 等1益心康胶囊和复方丹参片对心肌代谢及其耗氧量的影响1中药药理与临床,2000;16(2 359韩玲, 陈可冀1氧应激对线粒体的损伤及抗心肌缺血中药复方益心康胶囊含药血清的保护作用1中国心血管药理通讯,2000;233010Steven C. Hendricksonm , James D. St. Louis , James E. Lowe Abdel 2aleem. Free fatty acid metabolism during myocardial ischemia and reperfu 2sion. Molecular and Cellular Biochemistry ,1997;1668594E ffect of ischemia injury on myocardium bio 2membrane and the protective effect