酶工程学-第十三、十四周固定化

1、酶工程学酶工程学Enzyme Engineering第十十一周学习内容学习内容l绪论(第一章)第一章第一章酶工程学酶工程学l酶的生产l酶的改性l酶的应用酶生物合成的基本理论(第二章)酶的生物合成法(第三章)酶的提取与分离纯化(第四章)酶改性的基本理论(第五章)酶分子修饰(第六章)酶固定化酶固定化(第七章)酶的非水相催化(第八章)酶应用的基本理论(第九章)酶反应器的应用(第十章)酶的应用领域(第十一章)第七章第七章 酶固定化酶固定化Immobilized Enzyme l第一节第一节 概述概述l第二节第二节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素l第三节第三节 固定化酶的制备固定化

2、酶的制备l第四节第四节 固定化细胞固定化细胞l第五节第五节 固定化辅酶和原生质体固定化辅酶和原生质体l第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用酶反应器和固定化酶（细胞）的应用内容提要内容提要生物催化剂生物催化剂细胞细胞酶酶非生长非生长生长生长可溶可溶固定化固定化悬浮悬浮固定化固定化连续连续间歇间歇吸附吸附包埋包埋交联交联化学连续化学连续材料材料膜固定膜固定酶液酶液凝胶凝胶吸附吸附化学连接物化学连接物固定化固定化再循环系统再循环系统凝胶凝胶吸附吸附连续连续半连续半连续分批分批间歇间歇 连续连续活塞模式活塞模式搅拌连续反应器搅拌连续反应器间歇间歇连续连续活塞模式活塞模式搅拌连续反应器搅拌连续

3、反应器图6-1 生物催化剂作用方式示意第一节第一节 概概 述述游离酶的缺点：游离酶的缺点：1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。 3.反应结束后，酶成为产物的杂质。固定化酶：固定化酶：l固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化死细胞。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术固定化酶的优缺点固定化酶

4、的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难第二第二 节节 固定化酶的制备固定化酶的制备一、 一般方法及特点二、 酶的固定化方法一、一、 选择方法依据：选择方法依据： （1） 酶的性质（2） 载体的性质（3） 制备方法的选择二、二、 酶的固定化方法酶的固定化方法（一） 吸附法（二）结合法（三）交联法（四） 包埋法（一）（一） 吸附法吸附法1. 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。选择载体的原则： （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。常用载体：活性炭、氧化铝

5、、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石优点：缺点：结合力不劳、容易脱落。 吸附法常用的载体及优、缺点操作简单、条件温和、载体廉价易得、可反复使用。 （二）结合法（二）结合法l离子键结合法l共价键结合法定义：选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。1. 离子键结合法离子键结合法l概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。 l常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶l使用注意：pH、离子强度、温度+ +-+2. 共价键结合法共价键结合法l概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。 l可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑

6、基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键l常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式”l首先载体上引进活泼基团 l 然后活化该活泼基团l 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键载体活化的方法载体活化的方法A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D硅烷化法E溴化氰法A重氮法重氮法反应式： l目前在我们国内用的较多的载体：l该方法需要载体具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素琼脂糖葡聚糖凝胶琼脂l反应式及原理B 叠氮法叠氮法例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶步骤如下：l酯化l肼解l叠氮化l偶联C烷基化反应法烷

7、基化反应法l含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。D硅烷化法硅烷化法l载体特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 l常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。E 溴化氰法溴化氰法l本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。（三）（三） 交联法交联法l定义：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。1.

8、 交联法常用试剂交联法常用试剂戊二醛己二胺顺丁烯二酸酐双偶氮苯4,4-双(二甲氨基)偶氮苯2. 交联法的形式交联法的形式l交联法有2种形式：酶直接交联法酶辅助蛋白交联法l酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。EEEEEEl酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。EEE（四）（四） 包埋法包埋法l定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋

9、法。琼脂琼脂糖海藻酸钠角叉菜胶明胶聚丙烯酰胺 l载体：1网格型网格型定义：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。2微囊型包埋法微囊型包埋法定义：将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 微囊化法制备固定化酶有两种方法微囊化法制备固定化酶有两种方法l界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。l界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。癸二酰氯，氯仿癸二酰氯，氯仿酶，酶

10、， 水，水，乙二胺乙二胺第三节第三节 固定化酶的性质及其影响因素固定化酶的性质及其影响因素一、 影响固定化酶性质的因素二、固定化后酶性质的变化三、 评价固定化酶的指标一、一、 影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2 载体的影响（1） 分配效应（2） 空间障碍效应（3） 扩散限制效应3. 固定化方法的影响二、固定化后酶性质的变化二、固定化后酶性质的变化1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降原因：酶结构的变化 空间位阻2 固定化对酶稳定性的影响固定化对

11、酶稳定性的影响（1） 操作稳定性提高（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。（4 ）对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高三、固定化后酶稳定性提高的原因三、固定化后酶稳定性提高的原因l固定化后酶分子与载体多点连接。l酶活力的释放是缓慢的。l抑制自降解，提高了酶稳定性。四、四、 pH的影响的影响 （一）（一）pH对酶活性的影响：对酶活性的影响：（1） 改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。（二）（二）pH对固定化酶的影响对固定化酶的影响1. 载体带

12、负电荷，pH向碱性方向移动。2. 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。l催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高。l催化反应的产物为碱性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值低。（三）产物性质对体系（三）产物性质对体系pH的影响的影响（四）（四） 最适温度变化最适温度变化l作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化l既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特异性往往会变化。l一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。（五）底物特异性变化（五）底物特异性变化（六）米氏常数（六）米氏常数Km的变化，的变化，Km值随

13、载体性质变化值随载体性质变化（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km120.3-615营养要求简单简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗体、酶固定化细胞固定化细胞l定义：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的特点固定化细胞的特点l类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞l生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细

14、胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）l形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 l使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。细胞固定化方法细胞固定化方法l吸附法l包埋法吸附法吸附法l定义：通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 pH35- - - -+影响吸附法的主要因素影响吸附法的主要因素 lZ-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小l细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质l载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料包埋固定法包埋固定法 l包理

15、法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 包埋法常用载体：包埋法常用载体：l琼脂l海藻酸钙l角叉菜胶l明胶l聚丙烯酰胺举例：海藻酸钙包埋法举例：海藻酸钙包埋法l基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞。研究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 l例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯

16、预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶一、原生质体的制备二、固定化三、辅酶固定化一、原生质体的制备一、原生质体的制备l将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分离得到原生质体二、原生质体固定化的方法二、原生质体固定化的方法l将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。三、辅酶固定化三、辅酶固定化l原因l有机

17、辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应l有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生l有机辅因子价格昂贵l工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生辅酶固定化的方法辅酶固定化的方法l固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。l辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶固定化的形式辅酶固定化的形式第六节第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 l酶反应器介绍l反应器选择的依据l反应器和酶稳定性l固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化学、酶电

18、极、亲和色谱、环境保护、能源开发、基础理论研究）一、酶反应器一、酶反应器1 分批搅拌反应器。2 连续流搅拌桶反应器。3 连续搅拌桶-超滤反应器4 填充床反应器5 循环反应器6 流化床反应器 定义：用于各种酶进行催化反应的容器及其附属设备。类型：1 分批搅拌反应器分批搅拌反应器l反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验2 连续流搅拌桶反应器连续流搅拌桶反应器3 连续搅拌桶连续搅拌桶-超滤反应器超滤反应器酶循环4 填充床反应器填充床反应器5 循环反应器循环反应器6 流化床反应器流化床反应器l与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因

19、此流速要适当控制。反应器选择反应器选择l酶的形式：l底物的物理性质：l酶反应动力学l酶的稳定性l操作要求、应用和可塑性成本反应器和酶的稳定性反应器和酶的稳定性l反应器中酶催化活性损失的原因：l酶本身失效l酶从载体上脱落l载体肢解l扩散限制效应二、固定化酶（细胞）的应用二、固定化酶（细胞）的应用1. 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2 固定化酶在医药治疗上的应用3 固定化酶在分析化学中应用4 固定化酶和亲和色谱5 固定化酶与环境保护6 新能源开发中的应用7 固定化酶在基础理论研究中应用1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用l葡萄糖异构酶世界上生产规模最大

20、的一种固定化酶。l利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶l固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类l热点：固定化原生质体的应用2 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用l例1l固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOO OHH1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2)2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe)3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2)4: D-(-)-HPGM (

21、R1 = H, R2 = OMeH2OPenicillin G acylase+Ampicillin (RI = H)Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleusR2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+Penicillin G acylaseH2O7-ACCA (R3 = Cl)7-ADCA (R3 = Me)Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl)Cephalexin (R1 = H, R3 = Me)Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)7-ACCA or 7-ADCA as nucleusl - Reversible reaction l - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystl - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CHCOOHNH2CHCONHNSOCOOHCH3NH2H2NNSOCOOHCH3+H2NNSOCOOHCH3+Esterase HydrolaseSynthetasel例2：制造人工肾l利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的