关于五龙颗粒对变态反应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织白细胞介素mRNA

1、关于五龙颗粒对变态反应性鼻炎大鼠鼻黏膜组织白细胞介素mRNA表达的影响    【摘要】  目的 通过五龙颗粒对脾虚型变态反应性鼻炎(AR)大鼠白细胞介素-2、4、6 mRNA表达影响的研究,为健脾益气固表的五龙颗粒治疗AR提供理论依据。方法 采用病证结合的方法造模,用RT-PCR法检测鼻黏膜白细胞介素mRNA的表达。结果 五龙颗粒对实验性AR大鼠鼻黏膜处白细胞介素-2、4、6 mRNA的表达具有调节作用,升高的白细胞介素-4、6下降,降低的白细胞介素-2恢复。结论 五龙颗粒可

2、能通过调节细胞因子白细胞介素-2、4、6 mRNA的表达,对实验性AR大鼠发挥治疗作用( 【关键词】  五龙颗粒；变应性鼻炎；白细胞介素-2 mRNA；白细胞介素-4 mRNA；白细胞介素-6 mRNA     Abstract：Objective To study the effect of Wulong granules on the expression of IL-2&

3、#160;mRNA, IL-4 mRNA and IL-6 mRNA in allergic rhinitis (AR) rats in Spleen Qi deficiency type. To establish the clinic treatment principle-tonify Spleen and reinforce Qi 

4、;of AR through the lab study. Methods Established AR model with combination of disease and Zheng, checked the expression of IL-2 mRNA, IL-4 mRNA and IL-6 mRNA of

5、0;nasal mucosa were detected with RT-PCR. Results Wulong granules can adjust the expression of mRNA of AR rats' nasal mucosa. It can descend the ascensus of IL-4 

6、;mRNA, IL-6 mRNA and the drop of IL-2 mRNA. Conclusion Wulonggranules can show treatment effect to AR rats through adjusting the expression of cell factors such as I

7、L-2 mRNA, IL-4 mRNA and IL-6 mRNA.    Key words：Wulong-granules；allergic rhinitis；IL-2 mRNA；IL-4 mRNA；IL-6 mRNA     变态反应性鼻炎(AR)常与哮喘、荨麻疹等变态反应性疾病并存,其属于型变态反应。中医多认为内因为脏腑功能失调,脏腑虚损,正气不足,腠理疏松,卫表不固；外因多为风寒、异气之

8、邪侵袭鼻窍而致,寒邪束于皮毛,阳气无从泄越,故喷而上出为嚏。本实验从脾虚型AR入手,采用RT-PCR方法,从基因水平上研究五龙颗粒对实验性AR大鼠鼻黏膜白细胞介素-2、4、6 (IL-2、IL-4、IL-6)mRNA表达的影响,探讨五龙颗粒对脾虚型AR的影响及对该型AR的治疗机制。 1  实验材料 1.1  动物     SD大鼠42只,3月龄,体重180220 g,雌雄各半,四川省医学科学院实验动物研究所提供,合格证号0012110。饲养于成都中医药大学微生物与免疫实验中心,室内温度控制在20

9、25 。 1.2  药物及试剂    五龙颗粒,华神集团提供,药液原药材含量2.5 g/mL。息斯敏,西安杨森生产,用药前研磨成粉,用生理盐水配成0.03%的混悬液。卵白蛋白：美国Sigma公司生产,洛阳华美生物工程公司分装(医药学/临床医学论文 2  实验方法 2.1  分组及造模     SD大鼠自由喂养1周后,将大鼠按体重、性别随机分为7组,每组6只。即空白组、脾虚AR模型组、脾虚AR中药组、脾虚AR西药组、AR模型组、AR中药组

10、、AR西药组。    脾气虚模型：用饮食不节加游泳疲劳过度综合因素伤脾方法1。饮食不节：病证结合的脾虚AR模型组、脾虚AR中药组、脾虚AR西药组动物喂饲甘兰每只1015 g/d,自由饮水；双日猪脂2 mL/只灌胃,自由进食、饮水,共8 d。过劳伤气：以上各组动物在上述处理的当日放入20 水池中游泳至疲劳过度(以经驱赶无力游泳或欲溺水为指征),1次/d,共8 d。    AR模型：按照安氏2报道的方法造模,实验组动物以卵白蛋白0.30 mg作抗原,氢氧化铝粉

11、末30 mg作佐剂,加生理盐水1 mL形成混悬液,腹腔内注射,隔日1次,共7次。腹腔注射免疫完成后,在治疗的同时,每日给药1 h后再予以5%卵白蛋白溶液半量激发,即5%卵白蛋白溶液10 L,每侧5 L滴入大鼠双侧前鼻孔；模型组只激发不给药。空白组以生理盐水代替卵白蛋白,其余方法和步骤不变。 2.2  给药     造模结束后,即22 d后开始给药,给药时间为7 d。每日以成人临床剂量8倍的五龙颗粒(中药组)及息斯敏混悬液(西药组)灌胃,1次/d。空白组、AR模型组、

12、脾虚模型AR组：正常喂养,不给药物。 2.3  观察指标及检测方法 2.3.1  鼻黏膜IL-2 mRNA表达的RT-PCR检测  实验结束后,在超净工作台上取鼻黏膜用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法,进行IL-2 mRNA(信使RNA)水平表达的检测。具体方法如下：国际权威数据库中(http：//)查询相关SD大鼠基因全序列；用引物设计软件Primer&#

13、160;5.0设计出候选引物对；综合比较,找出最佳引物对；委托宝生物工程(大连)有限公司合成IL-2 mRNA引物：5'-CACTGACGCTTGTCCTCC- 3',3'-TTCGTCCGGTGTC TTAAC-5',采用美国TriZol试剂(Ne.15596-018)一步法提取总RNA反转录反应PCR反应,反应结果通过凝胶电泳系统检测。由于反应众多,为保障不同反应之间的可比性,采用不同反应产物带的相对荧光强度比值进行横向比较,确定不同基因在不同样本的相对表达程度。 2.3.2  鼻黏膜IL-4 mR

14、NA表达的RT-PCR检测  测试方法同IL-2 mRNA,引物设计为：5'-TGCTGTCACCCTGTTCTG-3', 3-GATGCTCCCTTTATGAACG-5。 2.3.3  鼻黏膜IL-6 mRNA表达的RT-PCR检测  测试方法同IL-2 mRNA,引物设计为：5'-CCACTGCCTTCCCTACTT-3', 3'-TATTGTTCTTTCTGTTTCGGTC-5'。 2.4  统计学方法  

15、60; 计量资料采用x±s表示；组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；方差齐性检验用Homageneity of variance test；如果方差齐者采用LSD法,方差不齐采用Tamhane's T2法。数据用SPSS11.5统计软件处理。 3  结果 (见表1)表1  五龙颗粒对AR大鼠鼻黏膜组织IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表达的影响(略) 注：与空白组比较,P<0.05,P<0.01；与脾虚AR模型组比较,P

16、<0.05,P<0.01；与AR模型组比较,P<0.05。 4  讨论    熊大经教授在多年的临床实践中发现,单纯的肺气虚寒型鼻鼽并不多见,而肺脾两虚型鼻鼽患者在临床上更为常见；认为肺气虚弱,卫气卫外功能必然减弱；而脾气虚弱,后天生化乏源,则不能助肺固表,以至邪干肺系,故治疗应从健脾入手,健脾益气,培补中土,从而达到培土生金、益气固表之目的。现代医学认为本病与遗传密切相关,带有与变应性鼻炎发病相关基因的特应型(atopic type)个体,并且本病的发生与宿主的免疫紊乱有关3。从而确立了本病的治疗关键在于

17、恢复机体的正常免疫机能状态,改善特应型体质。因此,选用党参、黄芪、白术、茯苓、山药等补中益气、健脾除湿；僵蚕、蝉蜕宣肺通窍、通络止痒；枸杞子、五味子益肾止涕,组成五龙颗粒。纵观全方,通过补中益气、健脾宣肺益肾,兼顾先天、后天,从而达到消除症状、改善体质的目的。    引起AR最重要的因素是变应原引起TH细胞的分化过程。在小鼠体内发现至少存在两种以上的TH细胞,它们分别合成不同的细胞因子。TH1细胞产生IL-2、TNF-和IFN-等,TH2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等。决定TH2分化的主要因素是IL-4,IL-4是由活化的TH2细胞

18、经抗原或丝裂原刺激而产生的一种细胞因子,除了TH2细胞外,自然杀伤细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞也分泌IL-4。其生物效应主要包括：诱导人B细胞产生IgE、IgG1；诱导杀伤T细胞和LAK细胞的杀伤活性,诱导单核-巨噬细胞表达MHC-类抗原；调节造血细胞的增殖和分化4。本实验模型组鼻黏膜组织IL-4 mRNA的表达明显升高,用药后治疗各组明显下降,表明五龙颗粒可以抑制IL-4 mRNA的表达,其可能抑制TH2细胞、NK细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞分泌IL-4,从而抑制IgE的合成,阻断变态反应性鼻炎的发作。    现已证明,IL-2在人体免

19、疫方面起着重要的作用。IL-2能增强巨噬细胞和自然杀伤 (nature killer,NK)细胞杀伤性,并可直接调节T细胞、B细胞分化增殖5。这些细胞表面均表达IL-2R,IL-2可与细胞表面的IL-2R结合而影响这些免疫细胞的功能。IL-2在哮喘中作用的研究报道尚有分歧,IL-2能直接促进T细胞进行有丝分裂,T细胞产生IL-4需要IL-2,IL-2可上调IL-4诱导的IgE合成,Maggi等认为IL-2可能在B细胞合成IgE中起重要作用。相反有报道IL-2能抑制正常人和过敏患者外周血单个核细胞由IL-4诱导的IgE、IgG4合成。Romano等6发现,特应症患者外周血单个

20、核细胞产生IL-2很少,Tac抗原表达很少,提示有IL-2产生缺陷。对IL-2在变应性疾病及脾虚证中的变化和作用,目前认识尚不一致,本实验结果表明,五龙颗粒对AR及脾虚引起的IL-2 mRNA的表达降低具有明显的恢复升高作用。    IL-6由多种细胞合成和分泌,包括活化的T细胞和B细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等,是一种抑制病毒复制的细胞因子,曾称为IFN-2。其生物学作用主要可增强T细胞产生IL-2和表达IL-2受体；诱导巨噬细胞和NK细胞分化。另外,IL-6刺激肝细胞合成急性期反应蛋白,可引起急性期炎症反应,被称为前炎症细胞因子。有研究表明

21、型变态反应患者,由变应原诱导的鼻黏膜晚期反应标本表达IL-6和IL-8 mRNA细胞数明显增加。其之所以选用攻击后24 h标本作为研究模型,是因为此时炎症细胞浸润数量达最高7。本实验研究结果表明,模型组鼻黏膜组织IL-6 mRNA的表达明显升高,用药后治疗各组显著下降；AR鼻黏膜在发作期伴有明显的炎症反应；五龙颗粒可能通过调节IL-6 mRNA的表达对实验性AR大鼠鼻黏膜晚期炎症反应起到抑制作用。  【参考文献】  1 李德新.脾虚证对生物膜结构与功能影响的实验研究J.辽宁中医杂志,1993,20(6)：39.2&

22、#160;安云芳.变应性鼻炎鼻黏膜P物质受体的研究J.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33(3)：139141.3 刘永祥.浅谈中医免疫学J.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,1999, 7(1)：5152.4 Mosmann TR,Cherwinski H,Bond MV,et al.Two types of murine helper T cell clone.I.Defintion according to profiles&

23、#160;of lymphokine activities and secreeted proteinsJ.Immunol,1986,136：2348.5 Symons. Soluble IL-2 recoptoe in rheumatoid orthritis, correlation with disease activity IL-1 and IL-2 inhibitionJ. I

24、mmunol,1988,141：2612.6 Romano MF, Valerio G, Turco MC, et al. Defect of CD2- and CD3- mediated activation pathways in T cells of atopic patients：role of interleukin 2J.Cell

25、60;Immunol,1992,139：91.7 Jacobsen M R, Varney V, Sudderick R, et al. Immunohistology of allegen-induced latenasal responsesJ.Allergy Clin Immunol, 1991,87：304. 免费论文下载中心  【摘要】  目的 通过五龙颗粒对脾虚型变

26、态反应性鼻炎(AR)大鼠白细胞介素-2、4、6 mRNA表达影响的研究,为健脾益气固表的五龙颗粒治疗AR提供理论依据。方法 采用病证结合的方法造模,用RT-PCR法检测鼻黏膜白细胞介素mRNA的表达。结果 五龙颗粒对实验性AR大鼠鼻黏膜处白细胞介素-2、4、6 mRNA的表达具有调节作用,升高的白细胞介素-4、6下降,降低的白细胞介素-2恢复。结论 五龙颗粒可能通过调节细胞因子白细胞介素-2、4、6 mRNA的表达,对实验性AR大鼠发挥治疗作用。  【关键词】  五龙颗粒；变应性鼻炎；白细胞介素-2

27、60;mRNA；白细胞介素-4 mRNA；白细胞介素-6 mRNA Effects of Wulong Granules on the Interlerkin mRNA Expression of Nasal Mucosa in Alergic Rhinitis Rats  FU Wen-yang, XIE Hiu, XIONG Da-jing 1.Shen

28、zhen Hospital of TCM, Shenzhen 518000, China；2.Chendu University of TCM, Chengdu 610075, China     Abstract：Objective To study the effect of Wulong granules on the expres

29、sion of IL-2 mRNA, IL-4 mRNA and IL-6 mRNA in allergic rhinitis (AR) rats in Spleen Qi deficiency type. To establish the clinic treatment principle-tonify Spleen and 

30、;reinforce Qi of AR through the lab study. Methods Established AR model with combination of disease and Zheng, checked the expression of IL-2 mRNA, IL-4 mRNA and IL-

31、6 mRNA of nasal mucosa were detected with RT-PCR. Results Wulong granules can adjust the expression of mRNA of AR rats' nasal mucosa. It can descend the ascensus

32、 of IL-4 mRNA, IL-6 mRNA and the drop of IL-2 mRNA. Conclusion Wulonggranules can show treatment effect to AR rats through adjusting the expression of cell factors&#

33、160;such as IL-2 mRNA, IL-4 mRNA and IL-6 mRNA.    Key words：Wulong-granules；allergic rhinitis；IL-2 mRNA；IL-4 mRNA；IL-6 mRNA     变态反应性鼻炎(AR)常与哮喘、荨麻疹等变态反应性疾病并存,其属于型变态反应。中医多认为内因为脏腑功能失调,脏腑虚损,正气

34、不足,腠理疏松,卫表不固；外因多为风寒、异气之邪侵袭鼻窍而致,寒邪束于皮毛,阳气无从泄越,故喷而上出为嚏。本实验从脾虚型AR入手,采用RT-PCR方法,从基因水平上研究五龙颗粒对实验性AR大鼠鼻黏膜白细胞介素-2、4、6 (IL-2、IL-4、IL-6)mRNA表达的影响,探讨五龙颗粒对脾虚型AR的影响及对该型AR的治疗机制。 1  实验材料 1.1  动物     SD大鼠42只,3月龄,体重180220 g,雌雄各半,四川省医学科学院实验动物研究所提供,合格证号0012110。饲养于成都中医

35、药大学微生物与免疫实验中心,室内温度控制在2025 。 1.2  药物及试剂    五龙颗粒,华神集团提供,药液原药材含量2.5 g/mL。息斯敏,西安杨森生产,用药前研磨成粉,用生理盐水配成0.03%的混悬液。卵白蛋白：美国Sigma公司生产,洛阳华美生物工程公司分装。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂,宝生物工程(大连)有限公司生产。PCR引物,宝生物工程(大连)有限公司合成。 2  实验方法 2.1  分组及造

36、模     SD大鼠自由喂养1周后,将大鼠按体重、性别随机分为7组,每组6只。即空白组、脾虚AR模型组、脾虚AR中药组、脾虚AR西药组、AR模型组、AR中药组、AR西药组。    脾气虚模型：用饮食不节加游泳疲劳过度综合因素伤脾方法1。饮食不节：病证结合的脾虚AR模型组、脾虚AR中药组、脾虚AR西药组动物喂饲甘兰每只1015 g/d,自由饮水；双日猪脂2 mL/只灌胃,自由进食、饮水,共8 d。过劳伤气：以上各组动物在上述处理的当日放入20 水池中游泳至疲劳过度(以经驱赶无力

37、游泳或欲溺水为指征),1次/d,共8 d。    AR模型：按照安氏2报道的方法造模,实验组动物以卵白蛋白0.30 mg作抗原,氢氧化铝粉末30 mg作佐剂,加生理盐水1 mL形成混悬液,腹腔内注射,隔日1次,共7次。腹腔注射免疫完成后,在治疗的同时,每日给药1 h后再予以5%卵白蛋白溶液半量激发,即5%卵白蛋白溶液10 L,每侧5 L滴入大鼠双侧前鼻孔；模型组只激发不给药。空白组以生理盐水代替卵白蛋白,其余方法和步骤不变。 2.2  给药   

38、  造模结束后,即22 d后开始给药,给药时间为7 d。每日以成人临床剂量8倍的五龙颗粒(中药组)及息斯敏混悬液(西药组)灌胃,1次/d。空白组、AR模型组、脾虚模型AR组：正常喂养,不给药物。 2.3  观察指标及检测方法 2.3.1  鼻黏膜IL-2 mRNA表达的RT-PCR检测  实验结束后,在超净工作台上取鼻黏膜用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法,进行IL-

39、2 mRNA(信使RNA)水平表达的检测。具体方法如下：国际权威数据库中(http：//)查询相关SD大鼠基因全序列；用引物设计软件Primer 5.0设计出候选引物对；综合比较,找出最佳引物对；委托宝生物工程(大连)有限公司合成IL-2 mRNA引物：5'-CACTGACGCTTGTCCTCC- 3',3'-TTCGTCCGGTGTC TTAAC-5',采用美国TriZol试剂(Ne.15596-018)一步法提取总RNA反转录反应PCR反应,反应结果通过凝胶电泳系统检测

40、。由于反应众多,为保障不同反应之间的可比性,采用不同反应产物带的相对荧光强度比值进行横向比较,确定不同基因在不同样本的相对表达程度。 2.3.2  鼻黏膜IL-4 mRNA表达的RT-PCR检测  测试方法同IL-2 mRNA,引物设计为：5'-TGCTGTCACCCTGTTCTG-3', 3-GATGCTCCCTTTATGAACG-5。 2.3.3  鼻黏膜IL-6 mRNA表达的RT-PCR检测  测试方法同IL-2 mRNA,引物设计为：5'-CCACTG

41、CCTTCCCTACTT-3', 3'-TATTGTTCTTTCTGTTTCGGTC-5'。 2.4  统计学方法    计量资料采用x±s表示；组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；方差齐性检验用Homageneity of variance test；如果方差齐者采用LSD法,方差不齐采用Tamhane's T2法。数据用SPSS11.5统计软件处理。 3  结果 (见表1)表1 

42、 五龙颗粒对AR大鼠鼻黏膜组织IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表达的影响(略) 注：与空白组比较,P<0.05,P<0.01；与脾虚AR模型组比较,P<0.05,P<0.01；与AR模型组比较,P<0.05。 4  讨论    熊大经教授在多年的临床实践中发现,单纯的肺气虚寒型鼻鼽并不多见,而肺脾两虚型鼻鼽患者在临床上更为常见；认为肺气虚弱,卫气卫外功能必然减弱；而脾气虚弱,后天生化乏源,则不能助肺固表,以至邪干肺系,故治疗应从健脾入手,健脾益气,培补中土,从而达到培土

43、生金、益气固表之目的。现代医学认为本病与遗传密切相关,带有与变应性鼻炎发病相关基因的特应型(atopic type)个体,并且本病的发生与宿主的免疫紊乱有关3。从而确立了本病的治疗关键在于恢复机体的正常免疫机能状态,改善特应型体质。因此,选用党参、黄芪、白术、茯苓、山药等补中益气、健脾除湿；僵蚕、蝉蜕宣肺通窍、通络止痒；枸杞子、五味子益肾止涕,组成五龙颗粒。纵观全方,通过补中益气、健脾宣肺益肾,兼顾先天、后天,从而达到消除症状、改善体质的目的。    引起AR最重要的因素是变应原引起TH细胞的分化过程。在小鼠体内发现至少存在两种以上的TH细胞,

44、它们分别合成不同的细胞因子。TH1细胞产生IL-2、TNF-和IFN-等,TH2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等。决定TH2分化的主要因素是IL-4,IL-4是由活化的TH2细胞经抗原或丝裂原刺激而产生的一种细胞因子,除了TH2细胞外,自然杀伤细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞也分泌IL-4。其生物效应主要包括：诱导人B细胞产生IgE、IgG1；诱导杀伤T细胞和LAK细胞的杀伤活性,诱导单核-巨噬细胞表达MHC-类抗原；调节造血细胞的增殖和分化4。本实验模型组鼻黏膜组织IL-4 mRNA的表达明显升高,用药后治疗各组明显下降,表明五龙颗粒可以抑制IL-4 mRN

45、A的表达,其可能抑制TH2细胞、NK细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞分泌IL-4,从而抑制IgE的合成,阻断变态反应性鼻炎的发作。    现已证明,IL-2在人体免疫方面起着重要的作用。IL-2能增强巨噬细胞和自然杀伤 (nature killer,NK)细胞杀伤性,并可直接调节T细胞、B细胞分化增殖5。这些细胞表面均表达IL-2R,IL-2可与细胞表面的IL-2R结合而影响这些免疫细胞的功能。IL-2在哮喘中作用的研究报道尚有分歧,IL-2能直接促进T细胞进行有丝分裂,T细胞产生IL-4需要IL-2,IL-2可上调IL-4诱导的IgE合成

46、,Maggi等认为IL-2可能在B细胞合成IgE中起重要作用。相反有报道IL-2能抑制正常人和过敏患者外周血单个核细胞由IL-4诱导的IgE、IgG4合成。Romano等6发现,特应症患者外周血单个核细胞产生IL-2很少,Tac抗原表达很少,提示有IL-2产生缺陷。对IL-2在变应性疾病及脾虚证中的变化和作用,目前认识尚不一致,本实验结果表明,五龙颗粒对AR及脾虚引起的IL-2 mRNA的表达降低具有明显的恢复升高作用。    IL-6由多种细胞合成和分泌,包括活化的T细胞和B细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等,是一种抑制病毒复制的细胞因子,曾称为IFN-2。其生物学作用主要可增强T细胞产生IL-2和