原核表达遇到瓶颈怎么办

1、我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果

2、以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。反正就是一种经验做法。跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。银染的灵敏度在0.11 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具

3、体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。 在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。还有个大家容易忽略的问题：就是要看基因中有没有细菌不常用的密码子如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶

4、缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET 相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）

5、也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。 没有发现原则性错误之后，最简单、快捷的就是改变一下表达温度、IPTG浓度。低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达，低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。有时表达的蛋白可能比预期的有不同，要认真研究电泳结果。如果尝试改变条件后依然没有表达，可以试试换不同的培养基。除了LB外还有TB、M9等，Novagen公司还有特殊的培养基出售补充各种细菌生长所需营养。 如果还是不行，考虑那么就剩下换换载体或者表达系统了。在换过不同载体，不同菌株之后仍是表达不出来的话，笔者的建议是：放弃吧。有些

6、蛋白是用大肠杆菌无法表达的，或许可以尝试其它的表达系统。毕竟，将构建好的质粒交给细菌后，有些事情是我们不能控制的，未知的。尝试其他的表达系统未尝不是一种办法。不过原核不能表达，转去做真核，也不保险，这时候试试体外表达，会更省事，因为没有细胞生长的限制，更容易得到结果，可能只是花费高些，产量低些。能做出结果是第一需要时，这些就不能计较太多。生物通将随后介绍几个体外表达系统，欢迎留意。 如果你成功表达出来了，首先要恭喜你，之后你仍然可能遇到各种各样的问题。这个很正常，科研的道路是曲折的嘛。 Q1：蛋白表达出来了，但是跑SDS-PAGE时大小不符？ 进行SDS-PAGE的时候蛋白的净电荷会影响迁移率

7、。带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。如果蛋白的等电点在5到9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。我们前面提到过，在很特殊的情况下稀有密码子的问题也会造成表达产物的截短。应加以考虑。这个时候最好利用C端或者N端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。如果排除以上因素仍是无法找出为何与预期大小相差很远，你只能苦命地重头再来。如果蛋白酶过高可以换个缺陷菌株试试。 Q2：蛋白不可溶，怎么办

8、？ 许多外源蛋白在大肠杆菌中表达后都是以包涵体形式存在，包涵体是一种致密、不可溶的颗粒。一般情况下，形成包涵体表达产率都很高，并且容易分离，得到比较纯的包含体。包涵体致密的结构有助于防止蛋白酶对它的降解作用，如果毒性较强的蛋白形成包涵体也就不会对细胞产生太大的损伤。如果你表达蛋白的目的是为了作为抗原制备抗体，那么出现包涵体也不算太坏，可以用PBS将包涵体悬浮，使用佐剂将溶液乳化后注射进入动物体内进行免疫。 包含体的形成据分析原因之一在于表达量过高，表达产物来不及折叠为活性形式多数以高表达见长的表达系统都会得到包含体产物。如果融合表达含有标签，常用的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯

9、化，然后复性。复性是表达下游最折磨人的步骤，生物通以后会逐步介绍。但是，在那之前你应该还要确定一下，你的蛋白真的是不可溶吗？细胞裂解是否完全呢？利用相差显微镜或者染色后对细胞裂解物进行观察。是否仍可以看到完整的细胞？裂解后的沉淀是否和之前收集细胞沉淀大小相似？裂解后溶液是否看起来澄清？以上任何一种情况出现都可能意味着细胞没有被彻底裂解而导致裂解上清检测不到产物。如果形成了包涵体，在比较高倍的（>400×）光镜下可以观察到大肠杆菌中有致密的结构。因为包涵体可能会占据细胞一半体积。 Q3：必须要可溶的蛋白，你可以怎么做？ 如果你希望得到能行使功能的蛋白，那么就最好还是想办法使蛋白以

10、可溶形式表达，包涵体复性也是一条十分曲折的道路。避免包涵体形成的方法很多，比如：选用表达量不高的表达系统，选择有助于可溶性表达的融合表达系统比如pThio，pMal等等，对于T7系统来说降低或者减少诱导条件（例如降低ITPG浓度减少T7聚合酶）从而降低表达速度，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株例如Novagen的Origami系列也有助于解决这个问题。生物通将在随后专门介绍几种特殊的用途的大肠杆菌菌株，不妨留意。 一般包涵体可以先使用温和变性剂（如：低浓度的尿素）和去污剂（如：Triton-X 100）将包涵体初步洗涤，之后用8M尿素将包涵体溶解。可以通过透析复性、或者是在过柱的时候复性。复性条件每个蛋白都是不一样的，所以是一条需要摸索前进的道路。 有人尝试当蛋白挂在柱子上的时候，在还原和氧化的谷胱甘肽存在的情况下用浓度从6M到0M的盐酸胍过柱，促使蛋白的折叠。在蛋白重新折叠后用咪唑洗脱。 Q4：切除标签时引入的蛋白酶是否一定要切除？ 很多时候我们要用蛋白酶除去加入的标签（除了NEB出有内含肽