去白细胞血对犬体外循环心肌缺血再灌注损伤中炎性因子的影响

1、去白细胞血对犬体外循环心肌缺血再灌注损伤中炎性因子的影响方华1，王泉云1，李昌熙1，刘兴奎2，喻田2，余志豪2（1.四川大学华西医院，四川 成都 610041；2.遵义医学院麻醉学系，贵州 遵义 563003）【摘要】 目的 探讨去白细胞血再灌注对犬体外循环（CPB ）中促炎性细胞因子引起的缺血心肌再灌注损伤的保护效果。方法 成年杂种犬18条，根据再灌注液成分不同随机分为对照组（C 组）、全血组（W 组）和去白细胞血组（L 组），每组6条。各组动物经麻醉和开胸后，建立体外循环心肌缺血再灌注实验模型。C 组在心肌缺血40min 后，于主动脉根部以2ml ·kg -1·min

2、-1灌入晶体再灌注液，持续20min 。W 组的再灌注液为新鲜动脉全血， L 组在再灌注通路中加用一次性白细胞滤过器（LDF ），再灌注液为去白细胞新鲜动脉血，余均同C 组。L 组分别测定滤过前后血液成分的变化。分别于CPB 前、转机5min 、阻断60min 、开放30min 和60min 取冠状窦静脉血，检测血清IL-1和IL-8浓度。并于阻断前、阻断60min 和开放60min 分别取心肌标本进行髓过氧化物酶（MPO ）活性和丙二醛（MDA ）检测，于阻断前、开放30min及开放60min测定血液动力学指标。结果 滤后白细胞计数显著低于滤前；阻断60min 后各组IL-1和IL-8浓度均

3、升高。阻断60min 和开放主动脉后，L 组白细胞数、IL-1和IL-8浓度显著低于C 组与W 组。与C 组和W 组比较，L 组阻断60min 和开放主动脉60min 时心肌组织匀浆MPO 活性和MDA 均显著降低。结论 CPB 中应用去白细胞血再灌注液可有效地抑制促炎性细胞因子的释放和活化白细胞介导的心肌缺血/再灌注损伤产生较好的心肌保护作用。【关键词】 去白细胞血 细胞因子 心肌保护 体外循环 缺血/再灌注损伤Effects of leukocyte-depleted blood on pro-inflammatory mediators during canine myocardial

4、ischemia/reperfusion in cardiopulmonary bypass. Fang hua,Wang Quanyun,Li chang xi, et al.West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041【Abstract 】 Objective To elucidate the protective effect of leukocyte-depleted blood on the pro-inflammatory cytokines-mediated myocardial ischemia-reperfusio

5、n injury during cardiopulmonary bypass (CPB. Methods Eighteen adult healthy hybrid dogs of either sex weighting 12-18kg undergoing CPB, were randomized into 3 groups: the control group (group C,n=6 ,whole blood (group W,n=6 and the experimental group(group L ,n=6 with it use of the leukocyte depleti

6、on filter(LDFon the bypass circuit. All the dogs were anesthesitized with 2.5% sodium pentobarbitone 25mg·kg-1. After tracheal intubation, continuous artery blood pressure and centre venous pressure(CVP were monitored from femoral artery and femoral vein during CPB. In group L,the hearts ,which

7、 were declamping(DC after 60min aortic cross-clamping (AC, were continuously reperfused for 20min with leukocyte-depleted artery blood 2ml·kg-1 by LDF connected with bypass circuit. Control group and group W were treated as group L but employing respectively physiological saline and artery bloo

8、d as a substitute for leukocyte-depleted blood. The blood cells account before and after the filtration were measured. The levels of coronary sinus venous blood serum IL-1 and IL-8 were detected at before CPB、5min following CPB、60min after AC and 30min、60min after DC respectively. Cardiac tissues sa

9、mples were taken for determination of the myeloperoxidase（MPO ）activity and the levels of malondialdehyde（MDA ） before CPB 、60min after AC and 60min after DC. Hemodynamic parameters were measured before CPB、60min after AC and 60min after DC. Results The white blood cell account decreased significant

10、ly after the filtration(P<0.01.Pro-inflammatory cytokines（IL-1and IL-8）concentrations increased significantly after DC in two groups but were notablely lower in group L than those in group C and W(P<0.01.MPO activity and MDA levels at 60min after AC and 60min after DC were distinctly lower in

11、group L than those in group C and W (P<0.01. Conclusions Pro-inflammatory cytokine（IL-1 and IL-8）and neutrophil might participate in inflammation-mediated myocardial ischemia-reperfusion injury which could be distinctly attenuated by infusion of leukocyte-depleted blood to the hear before DC. 【Ke

12、y words】 leukocyte-depleted blood; cytokine; myocardial protection; cardiopulmonary bypass; ischemia-reperfusion injury体外循环(CPB中，白细胞活化是引起全身性炎症反应综合征（SIRS）和心肌缺血再灌注损伤的主要因素之一1。活化白细胞不仅能够释放一些促炎性细胞因子（IL-1），还可以通过刺激缺血心肌释放趋化因子（IL-8）共同参与心肌缺血再灌注损伤，提示IL-1、IL-8与白细胞的协同作用在心肌缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用。研究证实，祛除或减少再灌注血液中的活化白细胞能

13、够有效地减轻心肌缺血再灌注损伤2，3，4，而白细胞、IL-1和IL-8共同参与心肌缺血再灌注损伤机制的研究较少，因此，本实验在犬体外循环中，于开放升主动脉前应用一次性白细胞滤过器（leukocyte depletion filter，LDF），通过滤除再灌注血液中的活化白细胞，观察白细胞、IL-1和IL-8在心肌缺血再灌注损伤过程中的相互关系。1 材料与方法1.1 主要试剂：犬IL-1、IL-8定量ELISA 试剂盒（法国DIACLONE 公司）；髓过氧化物酶（MPO）活性、丙二醛(MDA 试剂盒（均为中国南京建成生物工程研究所）。1.2 实验动物分组及心脏缺血再灌注动物模型的建立：成年健康杂

14、种犬18只(本院实验动物中心供，手术当日晨禁食，雌雄兼用，体重12-18kg，根据再灌注液的组成随机(单因素设计分为三组, 对照组（C组）、全血组（W组）和去白细胞血组（L组），每组6条。C组：麻醉后行气管内插管,连接呼吸机行机械通气(潮气量12ml ·kg -1,呼吸频率16次·min -1。右股动静脉置管进行平均动脉压（MAP）、中心静脉压（CVP）监测，并建立静脉通路，输注生理盐水8ml ·kg -1·h -1。右颈内静脉插入5F 四腔Swan-Ganz 漂浮导管到肺动脉总干,连接西门子sirecter-960型心脏电脑多功能监护仪热稀释法测定心输

15、出量。胸骨正中切口 ,切开心包，右心房内注射肝素3mg ·kg -1, 全身肝素化后左锁骨下动脉和右心房分别插管建立体外循环，升主动脉根部安置PERFEOT 心脏停跳液灌注器(北京普惠生物医学工程公司，用复方氯化钠溶液及706代血浆各500ml 预充Sarns5000型人工心肺机（美国3M 公司）及科威97型鼓泡式氧合器，转机流量为60-80ml ·kg -1·min -1，血液温度维持在2830，稳定转机5min 后阻断升主动脉，于主动脉根部经PERFEOT 灌入4标准 St.Thomas停搏液（K+20mmol ·L -1），灌注量均为10ml &#

16、183;kg -1。C组在心肌缺血40min 后，于主动脉根部以2ml ·kg -1·min -1灌入晶体再灌注液，持续20min，阻断升主动脉60min 时，全身复温至35开放升主动脉，开放升主动脉后观察循环情况60min。W 组再灌注液为犬新鲜动脉全血，而L 组在再灌注通路中加用一次性LDF（南京生物医学工程研究所），再灌注液为去白细胞新鲜动脉血，连接方法为从微栓过滤器出口与LDF 入口，LDF出口进入出血槽再由血泵入主动脉根部。余均同C 组。1.3 观察指标：各组采用酶联免疫吸附双抗体夹心法定量测定CPB 前、转机5min、阻断60min、开放30min 和60min

17、 时冠状窦静脉血IL-1和IL-8浓度，同期检测红细胞压积(Hct ,按Taylor 公式予以校正。于阻断前、阻断60min 和开放60min 分别取心肌标本用硫代巴比妥法测定MDA 含量,比色法测定髓过氧化物酶（MPO）活性。分别于阻断前、开放30min 及开放60min 时，采用SC7000心脏多功能监护仪(美国惠普公司测定心率、CVP 及MAP，并使用Swan-Ganz 漂浮导管热稀释法测定心输出量(CO，并输入犬体重及心率, 得出心脏指数(CI 和每搏量(SV，以评价心脏功能。L组应用LDF 前后检测去白细胞血和全血血液成分。1.4 统计学方法：数据资料以±s表示，组间相同时

18、间段比较采用两标本均数比较t 检验判定差异显著性，组内不同时间段采用团体t 检验判定差异显著性，P<0.05为显著性差异, P<0.01为非常显著差异。统计软件为SPSS11.0。2 结 果2.1 血液成分的变化：去白细胞血与全血的白细胞数目比较差异有统计学意义（P0.01），而血小板数和血红蛋白含量比较无统计学意义（P0.05）。见表1。表1 两种血液的变化（±s，n=6）注：与全血组比较，*P0.05，*P0.012.2 IL-1和IL-8浓度变化：对照组和全血组升高趋势一致,均在开放60min 时达最大值，两组从阻断60min 时IL-1和IL-8浓度明显增加，以后

19、各时段两组IL-1和IL-8浓度与本组CPB 前比较差异有统计学意义（P0.01）；全血组IL-1和IL-8浓度与同期对照组比较差异无统计学意义(P0.05。去白组IL-1浓度在阻断60min 时与本组CPB 前比较有增高,以后各时段有下降趋势，开放30min 和60min 分别与阻断60min 比较差异有统计学意义（P0.05）；去白组IL-1和IL-8浓度在开放30min 和60min 时与本组CPB 前比较均有增高，但分别与同项 目 全 血 去白细胞血 白细胞（x109/L） 4.28±0.25 0.36±0.29*血小板（x109/L） 126.75±3.

20、36 124.63±5.57 血红蛋白（g/L） 128.13±4.55 125.52±6.27 红细胞比容 0.37±0.10 0.33±0.10 pH 7.46±0.05 7.32±0.03 PaO212.38±2.7511.32±1.39期全血组和对照组比较差异均有统计学意义（P0.01）。去白组IL-8浓度阻断60min 与本组CPB 前 比较有增高, 但在开放60min 期间浓度基本稳定,开放30min 和60min 与阻断60min 比较差异无统计学意义（P0.05）。见表2。 2.3 MPO

21、活性和MDA 含量变化：阻断前,三组MPO 和MDA 差异均无统计学意义（P>0.05）。阻断60min 时和开放60min 时与阻断前比较,对照组及全血组的MPO 和MDA 均明显升高（P<0.01）。去白组MPO 活性和MDA 含量在阻断60min 时与本组阻断前比较差异无统计学意义（P>0.05）；去白组MPO 活性和MDA 含量在阻断60min 时显著低于同期全血组和对照组（P0.01）。开放60min 时去白组MPO 活性高于本组阻断前（P<0.01）和阻断60min（P<0.05），但与同期全血组和对照组比较差异均有统计学意义（P0.01）。去白组在开

22、放60min 时MDA 含量与本组阻断60min 比较差异无统计学意义（P>0.05）；在开放60min 时去白组MDA 含量高于本组阻断前（P<0.05），但显著低于同期全血组和对照组（P0.01）。见表3。 表2 三组犬血清IL-1、IL-8浓度的变化（pg/ml，±s，n=6）注：与本组阻断前比较，P0.05，*P0.01;与本组阻断60min 比较，P0.05， #P0.01; 与同期全血组比较，P0.05 ，P0.01;与同期对照组比较，P0.05， P0.01表3 心肌MPO（AU/g）活性及MDA（mol/g）含量变化（±s，n=6）注：与本组阻断

23、前比较，P0.05， *P0.01; 与本组阻断60min 比较，P0.05， #P0.01; 与同期全血组比较，P0.05， P0.01;与同期对照组比较，P0.05， P0.012.4 血液动力学的变化：开放后各组心脏均电击除颤,对照组心输出量在开放30min 和60min 时分别恢复到阻断前的64%与73%。去白组心输出量在开放30min 时恢复到阻断前的47%，但至开放60min 时恢复到阻断前的70%，与同期对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。全血组复跳时心脏心肌收缩力极弱,全血组心输出量在开放30min 和60min 时仅恢复到阻断前的8%和28%。见表4 。3 讨

24、论研究表明,白细胞浸润缺血心肌是心肌再灌注损伤的重要特征,白细胞引起的心脏损伤主要发生在主动脉开放后再灌注过程中4。体外循环（CPB）引起白细胞活化是心肌缺血再灌注损伤过程的“启动因子”之一,白细胞通过释放多种炎性介质激活炎性反应信号传导引起缺血心肌组织促炎性细胞因子基因表达上调5，6。MPO 是白细胞产生的特异性蛋白酶,MDA是白细胞活化过程中脂质过氧化作用的产物4,提示MPO 活力与MDA 含量不仅能够反映心肌组织内活化白细胞浸润的数目，还可以间接反映白细胞脱颗粒效应以及活化程度。本实验中,心肌缺血60min 时MPO 活力与MDA 含量明显升高,主动脉开放后,MPO活力与MDA 含量升高

25、更为显著，说明CPB 中组 别 CPB 前 转机5min阻断60min开放30min开放60minIL-1对照组 55.95±13.82 53.74±11.10 157.30±31.59* 196.73±26.43* 211.59±49.79* 全血组 58.61±12.47 62.17±15.29 164.52±27.48* 210.32±21.26* 209.63±23.03* 去白组 58.07±13.5959.63±12.91107.19±17.86*68.

26、38±13.61*60.38±13.49*IL-8对照组 65.27±18.73 64.24±17.35 181.12±19.18*222.82±19.19* 279.17±18.18* 全血组 61.30±15.36 70.35±14.63 227.40±22.71* 271.25±18.55* 283.09±15.89* 去白组66.37±16.2168.24±17.35134.55±8.57*134.63±14.79*128.46

27、±12.95*MPO MDA 组 别阻断前 阻断60min 开放60min阻断前 阻断60min 开放60min 对照组 0.41±0.16 2.30±0.97* 5.13±1.34* # 0.31±0.01 1.17±0.02* 2.03±0.02* # 全血组 0.36±0.49 3.71±0.68*5.81±0.92* # 0.27±0.13 1.30±0.15* 1.85±0.09* 去白组0.47±0.280.63±0.181.24&#

28、177;0.25*0.33±0.020.45±0.080.81±0.05表4 三组犬血液动力学指标的变化（±s，n=6）注：与本组阻断前比较，P0.05， *P0.01;与同期全血组比较，P0.05， P0.01;与同期对照组比较，P0.05， P0.01大量白细胞活化,开放升主动脉后虽然恢复心脏的供血供氧,但血液中的白细胞等可以通过大量释放MPO 和MDA 等炎性因子引起缺血心肌再灌注损伤。IL-1主要是由白细胞，特别是由中性粒细胞和单核细胞合成分泌的一种重要的前炎性细胞因子。IL-1能够通过分泌-促分泌反馈环路机制参与白细胞活化的炎性过程,包括直接激

29、活白细胞和先激活心血管组织的ICAM-1表达而间接作用于白细胞7；IL-1还可以直接激活花生四烯酸代谢途径,诱导白细胞产生大量活性氧作用于心肌细胞膜引起脂质过氧化,导致心肌组织损伤加重8。IL-8是趋化白细胞向缺血心肌聚集和移行的关键因子,它对白细胞的趋化作用具有高度的选择性9。IL-8作为白细胞的重要趋化蛋白之一,不仅能够促进外周血白细胞数目迅速增加10,还参与了心肌缺血再灌注损伤11。本研究中,心肌缺血60min 时IL-1和IL-8浓度明显升高,主动脉开放后,IL-1和IL-8浓度升高更为显著；提示, CPB 期间诸多因素如缺血再灌注等均可启动炎性信号传导引起活化白细胞、心肌细胞等合成和

30、释放IL-1和IL-812，13，活化白细胞不仅能够释放IL-1，还于血流再灌注过程中刺激缺血心肌释放IL-812,从而使炎性细胞因子生成和释放增加,引起心脏急性炎性反应,而发生炎性反应的心脏心功能恢复延迟, 心输出量下降, 说明IL-1、IL-8与白细胞的协同效应在心肌缺血再灌注损伤过程中起着重要的作用。 本研究观察到CPB 期间LDF 对动脉血中白细胞的祛除效果较好,滤除率高达90以上,去白细胞再灌注血液中白细胞计数较动脉血显著减少。研究证实,去白细胞血再灌注的心肌保护作用显著优于全血再灌注2，3，4；而IL-1和IL-8浓度持续升高与肌钙蛋白-I显著相关14，15,与术后心脏指数呈负相关

31、16,与术后心功能恶化关系密切17。本研究中,开放升主动脉前使用LDF 滤除动脉血中白细胞，IL-1和IL-8浓度较对照组和全血组明显减低,再灌注后心肌MPO 活性和MDA 含量也明显下降,且血液动力学指标恢复迅速,说明开放升主动脉前使用滤除白细胞的新鲜动脉血灌注缺血心脏不仅有效地清除了蓄积在心肌的代谢产物,并为缺血心脏供血、供氧和提供能量,使心肌组织的氧化代谢尽早恢复,还通过最大限度地减轻活化白细胞对缺血心脏的危害、间接减少了白细胞产生的IL-1和抑制缺血心肌组织炎性反应信号传导系统合成释放IL-85，6等途径,对减轻心脏局部炎性反应引起的炎性损伤起到重要作用,阻止了心肌缺血性损害的延续并促

32、使其损伤的修复以及预防再灌注损伤的发生,从而对缺血心脏产生较为有效的保护作用。本研究结果表明，促炎性细胞因子的产生、白细胞活化以及缺血心肌再灌注损伤三者之间存在着密切的联系。对于缺血心脏，通过控制再灌注条件和再灌注液成分能够产生心肌保护作用，而直接滤除再灌注血液中活化的白细胞、延长去白细胞血的灌注时间和间接抑制促炎性细胞因子IL-1和IL-8等的产生可以减轻缺血心肌的再灌注损伤。参考文献：1 Gessler P, Pfenninger J, Pfammatter JP, et al. Inflammatory response of neutrophil 组别 阻断前开放30min开放60mi

33、nCO(L/min对照组 1.23±0.13 0.79±0.06* 0.90±0.05* 全血组 1.18±0.09 0.10±0.05* 0.33±0.08* 去白组1.20±0.120.56±0.090.84±0.13CI(L/min-1.m -2对照组 2.19±0.22 1.35±0.11*1.55±0.09* 全血组 1.85±0.31 0.17±0.09* 0.56±0.14* 去白组 2.02±0.190.95±

34、0.15*1.43±0.22SV(ml/beat对照组 10.61±1.12 5.64±0.43* 7.26±0.41* 全血组 10.17±0.78 1.21±0.64* 2.02±0.53* 去白组9.35±0.914.63±0.74*7.57±1.17granulocytes and monocytes after cardiopulmonary bypass in pediatric cardiac surgery. Intensive Care Med. 2002 Dec;28(12:

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