βcatenin在白血病细胞系中表达的研究

1、catenin在白血病细胞系中表达的研究         08-03-10 10:33:00     编辑：studa20                    作者：麦玉洁 ，邱录贵 ，李增军 ，李新， 王国蓉，      &#

2、160;                         于珍，徐燕 ，王亚非 ，李茜【摘要】  本研究检测catenin在白血病/淋巴瘤细胞系中的表达，探讨其与白血病的关系。采用半定量RTPCR、免疫细胞化学和Western blot的方法检测catenin在白血病细胞系中的表达。结果表明: 白血病细胞系中catenin在转录水平上有广泛表达，其

3、中：在U937、KG1a、 Jurkat、K562、Namalwa细胞中存在极高表达；在HEL、HUT78、Raji、Daudi、CEM中有中等表达；而在LCLH、HL60、NB4、J61、Ramos细胞中catenin mRNA呈相对较低水平的表达。蛋白表达水平与mRNA表达水平结果一致。所检测的细胞系中，胞核中均可见catenin的表达，但程度不一;在U937、K562、KG1a 和Jurkat细胞的胞核内可见大量分布。结论: catenin作为WNT/catenin信号转导途径中重要的“调节子”，其在白血病细胞中的过量表达提示WNT/catenin信号转导途径可能在白血病细胞中有异常激活

4、。 【关键词】  白血病细胞系     Expression of Catenin in Leukemic Cell Lines       Abstract    This study was aimed to investigate the expression of catenin in leukemic cell lines and its relationship with pathogenesis of leukemia, semiquanti

5、tative   RTPCR and Western blot were performed to detect the expression of catenin in a panel of 15 human hematopoietic cell lines (U937, KG1a, Jurkat, K562, Namalwa, HEL, HUT78, Raji, Daudi, CEM, LCLH, HL60, NB4, J61, Ramos). Immunocytochemistry was  performed in some of these cell l

6、ines to detect the location of catenin. The results showed that the  catenin gene was widely expressed in most leukemic cell lines  in various  degree, the high expression of    catenin was found is U937, KG1a, Jurkat, K562 and Namalwa cells, middle erpression of cateni

7、n was observed in  HEL, HUT78, Raji, Daudi and CEM cells, lower expression of catenin was observed in  LCLH, HL60, NB4, J61 and  Ramos cells. The expression level of catenin protein was identical to the expression level of catenin mRNA. The expression of catenin could be found in nucl

8、ei of all cells mentioned above, but their levels were different belween them.  Abundant catenin also could  be observed in nuclei of some leukemic cells by immunocytochemistry.  It is concluded that overexpression of  catenin   in leukemia cells, as a key mediator of W

9、nt signaling transduction  pathway,    indicates that the  Wnt signaling transduction pathway may  be aberrantly activated in leukemia.    Key words    catenin; leukemic cell lines; WNt/catenin  signaling pathway    

10、;  catenin首先是作为一种黏附分子被发现1。近年来越来越多的研究表明，它同时又是一种转录因子，在Wnt信号转导途径中参与基因的表达和调控2。其异常激活与多种实体瘤的关系已经明确，但在白血病中的作用尚未证实。我们采用半定量RTPCR、免疫组织化学及Western blot的方法检测catenin在白血病细胞系中的表达水平，并初步探讨其与白血病的关系。    材料和方法    细胞培养    人白血病细胞/淋巴瘤细胞系：K562、HL60、NB4、 U937、 KG1a、Jurkat、HEL

11、、CEM、Namalwa、Ramos、LCLH细胞系由本室常规保存，Raji、 Daudi、 HUT78由我所廖晓龙教授赠送。细胞生长于含10%灭活新生小牛血清、1×105 U/ ml青霉素和10 mg/ml链霉素的RPMI 1640完全培养液中，置于37、5% CO2 、饱和湿度培养箱内培养。人白血病细胞系J61细胞由我所吴克复教授赠赠，源自1976年1名疑似急性髓单核白血病（AMML）患者，除需在IMDM中加入20 NCS外,其余培养条件同其他细胞系4。   总RNA的提取  收集1×106细胞，以TRIzoL reagent (Invit

12、rogen公司产品) 提取细胞总RNA, 氯仿相分离,异丙醇沉淀，乙醇洗涤RNA团块，干燥并DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度法测定RNA的量， A260/ A280鉴定RNA纯度。    RTPCR  以OligodT(18)法逆转录为cDNA，扩增catenin和内参照actin。扩增条件:catenin：95 30秒, 55.5 30秒,72 30秒， 共30个循环；catenin正义链：5AGCCGACACCAAGAAGCAG     3,catenin反义链：5GGCCACCCATCTCATGTTC 3

13、，扩增长度808 bp；actin(作为内参)：95 30秒,60 30秒，72 30秒，共25个循环，actin正义链5ATCTGGCACCACACCTTCTACA3，actin反义链5GTTTCGTGGATGCCACAGGACT3，扩增长度569 bp。引物由上海Sangon合成，PAGE纯化。    catenin的半定量分析    取PCR产物5 l，在15 g/ L琼脂糖凝胶(含0. 5 g/ ml溴化乙锭) 上电泳(80 V, 30分钟)后,紫外灯下观察、照相，用Kodak Digital Science 1D Image

14、 Analysis Software及GDS1数字化凝胶成像分析仪扫描，按下列公式计算catenin的相对表达量。    Rcatenin吸光度比值/actin吸光度比值    免疫细胞化学染色    采用ABC免疫酶标法进行。细胞甩片后经冷丙酮固定20分钟。然后用10% 的正常羊血清封闭20分钟,置一抗湿盒中(一抗为鼠抗人单克隆抗体，150稀释，阴性对照以PBS代替)，于37孵育2小时。用PBS洗3次，滴加生物素标记二抗（北京中山公司产品），37孵育30分钟，用PBS洗3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉

15、卵白素，37孵育30分钟，用PBS洗3次，DAB显色液中5-10分钟。苏木精复染细胞核,常规逐级乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封固。    catenin蛋白表达的Western blot检测    取1×107细胞，用PBS洗涤后悬浮于RIPA裂解液中（50 mmol/L Tris，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1% NP40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA，100 mg/L PMSF，1 mg/L Aprotinin，2 mg/L Leupeptin，1 mmol/L

16、DTT），超声裂解，10 000 rmp离心10分钟，取上清，以Bradford assay法测定蛋白浓度。取200 g总蛋白，进行聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜。5脱脂奶封闭过夜后，加入一抗（11000稀释）孵育2小时，用TBST洗涤。室温孵育二抗2小时, TBST洗涤后，用ECL法检测（Santa Cruz公司）。    统计学处理    catenin相对表达量R>1.0认为高表达，0.6<R<1.0认为中等表达，R<0.6认为低水平表达。< p>     结    果    catenin基因在白血病细胞系中的表达    在所检测的15种细胞系中都可检测到catenin的表达，但程度不一。在U937、KG1a、Jurkat、K562、Namalwa细胞中有极高表达（R>1.0）；在HEL、HUT78、Raji、Daudi、CEM中中等表达（0.6<R<1.0）；而在LCLH、HL60、NB4、J61、RAMOS细胞中&BETA;CATEN