非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用

1、非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用3张汉波1,333段昌群2,3屈良鹄3(1云南大学生物学系,昆明650091;2云南大学环境科学系,昆明650091;3中山大学基因工程教育部重点实验室,广州510275摘要由于有相当数量的土壤微生物是目前不可培养的,因此利用传统培养技术来研究土壤微生物,不仅费时费力,所得到的结果可能和真实的情况相差甚远。近年来发展了三类不需培养的方法来研究土壤微生物的种类和数量,这些方法大体上分为生物化学、生理学和分子生物学三类。生物化学方法主要根据细胞膜磷脂酸(PL FA 的种类和数量来判定微生物的多样性;BIOLO G 微量板分析系统是生理学方法的代表,它主要是根

2、据土样细胞悬液对95种单一碳源的利用模式来说明群落结构的变化;分子生物学方法是发展应用最广的方法,基本步骤是提取土壤的总DNA ,然后用通用引物或选择性高的引物来扩增16SrRNA 基因。由于对扩增产物分析方法的不同,该方法又可分为PCR 2D GGE ,PCR 2RFL P 等。最近在PCR 2RFL P 基础上发展起来的T 2RFL P 分析方法,将微生物的多样性分析工作同RDP (ribosomal database project 数据库结合,充分利用了Internet 的数据资源共享的优势,具有分辨率高,可实现自动化等优点,是未来土壤微生物生态学研究的有力工具。关键词微生物多样性,磷

3、脂酸,BIOLO G 微量板分析,末端限制性酶切片段长度多态性中图分类号X172文献标识码A 文章编号1000-4890(200305-0131-06Culture independent methods for studies on microbial ecolo gy of soils.ZHAN G Hanbo 1,3,DUAN Changqun 2,3,QU Lianghu 3(1Depart ment of Biology ,Y unnan U niversity ,Kunming 650091,China ;2Depart ment of Environmental Science

4、,Y unnan U niversity ,Kunming 650091,China ;3Gene Engineering Key L aboratory ,Minist ry of Education ,Zhongshan U niversity ,Guangz hou 510275,China .Chinese Journal of Ecology ,2003,22(5:131136.Since most species of microorganisms in soils are not cultivable in the laboratory ,the investigation of

5、 their communities is a time 2consuming and hard work by traditional culture procedure.Moreover ,some wrong conclusions may be drawn.In the past decades ,three kinds of culture 2independent methods have been developed so that great progress has been made in this field.The biochemical method is to de

6、terminate the microbial communities b y analysis of phospholipid fatty acids (PL FA of cell membrane.The metabolism 2based approach ,through observations of the utilization patterns of 95single 2carbon sources performed on the BIOLO G microplates ,can provide a lot of information about the microbial

7、 functional groups in the soils.The third method ,molecular techniques ,is most prevalently used to explore the microbial communities.Briefly ,the molecular approach was started with the extraction and purification of total DNA from sam ple soils ,followed by PCR 2amplification of 16SrRNA gene with

8、universal or s pecial primers.As the analysis procedure of PCR products is dif 2ferent ,a variety of approaches ,for example ,D GGE ,RFL P and T 2RFL P ,have been established since 1990s.Among them ,T 2RFL P was developed based on the RFL P in 1997.This method com 2bined ribosomal database project (

9、RDP into the analysis of microbial communities ,and the number and constituents of s pecies within a community were inferred just according to the number and inten 2sity of the terminal restriction fragments of 16S rRNA gene.Performing T 2RFL P is simple ,with high resolution ,and can be carried out

10、 automatically.Therefove it will play more and more impor 2tant role in future research in microbial ecology of soils.K ey w ords microbial diversity ,phospholipid fatty acid ,BIOLO G microplates assay ,terminal re 2striction fragment length polymorphism.3云南省工业微生物发酵工程重点实验室开放基金项目(KF2001201;云南省自然科学基金项

11、目(2002C0001Q 、国家自然科学基金项目(39970142、云南省教育厅自然科学基金重点项目资助(02ZD013和中山大学教育部基因工程重点实验室开放基金资助项目。33通讯作者收稿日期:2002-05-04改回日期:2002-11-151引言土壤微生物是土壤分解系统的基本组成部分,在生物地化循环中有极其重要的作用。据估计,土生态学杂志Chinese Journal of Ecology 2003,22(5:131136壤中原核生物的数量约为216×1026个细胞,含有的N、P与陆生植物相当。如此巨大的生物群体和它们快速的生长率产生了极大的遗传多样性,构成了地球上生物遗传多样性

12、的大部分1,2。丰富多样的微生物种类不仅是维持土壤健康的重要因素,多样性的变化也是监测土壤质量变化的敏感指标,因此土壤微生物的种类和数量一直是微生物生态学研究的重要内容。由于土壤微生物种群固有的特点,考察其种的丰富度和均一度是个极其艰巨的任务,主要体现在以下三个方面。一是种类繁多。估计每1g土壤约有4×1034×104个种5,全球仅细菌数就可达10 50万之多1;二是目前能培养的种类很少。传统的培养技术仅能分离1%10%的土壤微生物5;三是重培养过程本身是一个重新选择的过程,得出的结果并不能反映原始的群落结构17。近年来基于生物化学、生理学和分子生物学发展起来的三大类新方法

13、,力图克服培养这个难点,对土壤微生物生态的研究产生了极大的促进作用。本文就这几个方法的应用原理以及它们的特点等进行评述。2生物化学方法的代表磷脂酸法PL FA存在于细胞膜中,由于不同的微生物具有不同的PL FA种类和数量,因此可以作为了解自然环境中微生物种类组成和数量变化的指标。但PL FA模式并不能给出一个实际的微生物种类组成,仅是群落结构的概图。在有的情况下,某种PL FA的浓度改变与某些特异的微生物类群的改变密切相关22。PL FA分析的原理和方法。取一定量的待分析土样(015g左右的新鲜土壤或210g干土,加氯仿2甲醇2柠檬酸(12018缓冲液直接抽提样品的总PL FA,提取的PL F

14、A经硅胶柱分离为中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸。磷脂酸溶于甲醇/甲苯(11,v/v溶液,然后加012molL-1KOH,37酯化15min后8,用气相色谱分析磷脂酸甲酯。磷脂酸的种类用总碳原子数:双键数量表示,紧跟着后面的数字表示双键离甲基末端的位置。前缀a和i分别表示有anteiso和iso分支;br表示未知的分支;cy 表示环丙烷(cyclopropane脂肪酸;Me表示甲基团离羧端的位置。分析结果可根据以下一些标准来判定:一般来说,i15:0,a15:0,15:0,i16:0,16:19, 16:7t,i17:0,a17:0,cy17:0,18:17和cy19:0是细菌特有的,它们的总合可

15、代表细菌生物量; 18:26是真菌代表;真菌PL FA/细菌PL FA可代表土壤中真菌和细菌数量比例;放线菌常在离羧端第10碳原子上有一个甲基团,因此10Me18:0被用来作为放线菌存在的标志9;脂肪酸的浓度可用甲基十九烷脂肪酸(190作为内标来进行定量测定,总量用nmolcm-3表示9,22;G+细菌有更多的iso-,anteiso-,或者其他分支脂肪酸,G-细菌有较多的单一未饱和脂肪酸或环脂肪酸9。该法检测灵敏度高,单个脂肪酸的最低检测水平是4pmolg-1土壤16。PL FA的分析结果有时要结合生态因子进行综合评价,才能获得准确的信息。Pennanen等22测定受重金属污染的针叶林土壤的

16、微生物多样性发现,样品中1826脂肪酸随污染程度的加重,数量急剧降低,表明该地区真菌数量随污染的加重急剧减少。由于真菌相对细菌来说对重金属的污染不敏感,这种相反的结果要结合样地的情况来解释。因土壤中该脂肪酸主要来自外生菌根菌,在污染严重的样地,植物急剧减少,该脂肪酸的比例下降是可以理解的。另外,1615是内生菌根真菌的代表脂肪酸,但它在细菌中也有发现。因为研究样地植物稀少,该脂肪酸代表的应是细菌而不是菌根真菌的情况。3生理学的方法BIOLOG微量分析B IOLO G微量板分析系统是由Biolog公司发展,用来测定微生物对95种碳源的利用情况并据此来对化能异养细菌进行鉴定的系统。G arland

17、等10首先报道了这种碳源利用信息可把一些不同种类的土壤和水体的微生物区系区别开。Zak等28把这种系统作为一种定量方法用来评价与6种植物区系相关的微生物群体的功能多样性。Haack等12进一步的研究表明了模式细菌群落的利用情况重现性很好。近年来,该方法在分析不同土壤特别是重金属污染土壤中的微生物多样性方面显示了越来越重要的作用6,1315,19。另外,在实验室长期培养传代的微生物群体遗传结构的差异研究方面也有初步的尝试7,23。B IOLO G依据的原理很简单,在分析板上有96个孔,一个孔没有含任何碳源作对照,其余95个孔每孔含有一种碳源和氧化还原染料四氮唑蓝。底物利用产生的氧化还原电势的变化

18、可导致染料的颜色231生态学杂志第22卷第5期发生变化,变化的速率和程度代表了底物被利用的速率和程度。微生物群落结构不同,95个孔的颜色变化方式就不同,这样可以知道不同样点微生物区系的差异。其方法是取一定的土壤(10g干重土壤,溶于90ml无菌缓冲溶液中并摇匀。静止一段时间后,取上清液稀释,用不同的稀释液接种,25培养观察。每隔一定时间通过B IOLO G微量板阅读器阅读一次,建立一个颜色变化同时间的线性关系并据此确定适合的接种量和培养时间6,15。然后利用B IOLO G分析不同样点的B IOLO G值进行聚类分析比较,最后通过SAS统计软件进行主成分分析(PCA。详细的B IOLO G数据

19、分析见相关参考文献13,14。Knight等15利用B IOLO G分析不同p H和重金属处理的沙壤土的微生物多样性变化时发现,代谢活性低的样品,碳源的利用模式重现性较差,活性高的样品重现性好;就某个碳源来说,利用强度变化较大。Bossio等6认为,对于粘土,用1000倍稀释液接种较合适。稀释度太低,较多的粘土会干扰阅读,稀释度太高,接种量小而导致重复实验结果不稳定。为了避免丢失细胞,接种时无需离心去除土壤颗粒。4分子生物学方法基于DNA和RNA信息,特别是16SrRNA基因来研究微生物多样性的分子生物学方法,在土壤微生物的研究中显示了极大的应用前景11。这类方法的共同点都是首先从土壤中提取总

20、DNA,选择合适的引物进行PCR扩增。对扩增产物的分析方法不同可以分为PCR2D GGE,PCR2RFL P(又称为ARDRA等,关于它们的应用例子和详细的说明可参考相关文章和评述24,21,25,27,本文主要对基于RFL P建立起来的一种新的方法末端限制性酶切长度片段多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T2RFL P研究方法进行详细的介绍。T2RFL P法的步骤是:提取总DNA,保守区序列为引物扩增16SrRNA基因。引物的5端(或3端有荧光标记,以便给扩增产物加上标签。扩增产物通常用42碱基识别位点的内切酶消化,用自

21、动化DNA测序仪分析带荧光标记的5末端限制性片段的大小和浓度。根据特异片段的数量可以表明微生物区系的多样性,还可根据已知序列鉴定到种,荧光强度的大小可以确定种的丰富度17,18。Liu等17首先探索了方法的可行性。他们先从RDP数据库中选择1007个真细菌序列和95个古菌序列。再选择4对引物,用匹配软件计算引物同上述序列的配对特异性并预测了10个4-bp识别位点的限制性酶如A l u I(A GCT、Bst U I(CGCG等消化后的T2RFs(末端限制性酶切片段的理论长度。配对特异性通过总序列中可以配对的百分比表示,T2RFs长度出现的频率用SAS进行统计分析。研究表明,引物对8f2926r

22、可以和上述1102个序列中的686个配对,用Hha I消化后,可以产生194个长度特异性的5末端片段,如果用Hha I同Msp I组合消化,特异性片段的数量可提高到233个(图1。根据模拟的结果,用两种荧光标记8f2926r引物对,扩增了人工模式群体(包含6个已知菌株:A l2 caligenes f aecalis ALC1,Ralstonia eut ropha, A rthrobacter globif orm is A TCC8010,B acill us sub2 tilis BAC11,Escherichia coli HB101,Pseudomonas aerugi nosa A

23、 TCC27853的16SrRNA基因,产物用Hha I消化,经自动测序仪分离消化产物。由于两个引物用的是不同颜色的荧光标记,因此分离后每个菌株产生了两个末端片段(5和3端。荧光标记可以确保分析仪仅测定了末端的片段。结果可以清楚地看到,不管是用5还是3末端片段的大小和数量,都可以准确地判定混合群体中有6个不同的群体(图2。接下来,他们用这样的方法评价了活性污泥等4个天然微生物群体的多样性。研究表明,用T2RFs长度片段多态性来分析微生物群落多样性的可行性。使用T2RFL P分析依赖于采用合适的引物对和消化酶,以便得到最大数量的特异性末端片段。这样,分析前必须要了解所有16SrDNA上的限制性酶

24、切位点、片段大小和种系的关系。Marsh等18发展了一个网站(www1cme1msu1edu/RDP/trflp/#pro2 gram,将种系统发育树、模式查询运算法则(a pat2 tern2searching algorithm同RDP(ribosomal database project进行整合,提供研究者快速的决定合适引物和限制性酶的组合。另外,也可随时通过数据库中的同源种(cognate phylotypes来进一步鉴定通过实验定的种。该网站还可回答下列有关使用T2RFL P 的问题:估计群体多样性采用什么样的限制酶最合适;什么酶可以最好的分辨所感兴趣的种群;331张汉波等:非培养方

25、法在土壤微生物生态学研究中的应用图1 计算机模拟得到的末端长度片段多态性Fig.1H istograms of the predicated 5T 2RFS lengths by computer simulation图2模式群落的电泳Fig.2E lectropherograms of model community最适合你所调查的区系的引物2酶组合。该网站已变更至:www 1cme 1msu 1edu/RDP/html/index 1html ,详细的内容可到网上查询。5结语在微生物生态学的研究工作中应用非培养的技术,无疑克服了培养过程产生的很多困难,提高了研究结果的真实性。但研究天然土壤

26、的微生物种类和数量的变化本身是一个极其艰巨的任务,面临的可变因素极为复杂,因此没有一个方法是十全十美的。对于PL FA 来说,特殊仪器设备的要求和复杂的实验方法限制了它的应用。另外,PL FA 的一个峰可431生态学杂志第22卷第5期能含有不同种的细菌的脂肪酸27。因此,在大多数情况下只能通过PL FA数量和种类来初步判定不同土样间群落结构的差异,更细节的信息该方法将无能为力。但该方法对细胞生理活性没有特殊的要求。对样品保存的时间也要求不高。B IOLO G分析主要依赖群体的生理活性,特别是脱氢酶活性,因此,该法不能检测到休眠群体,也不能检测到那些不能利用B IOLO G底物的群体。此外,如果

27、不能很好地解释一个区系中微生物种类的相互作用如何影响底物的利用情况,很难把这些变化同种类变化联系起来。另外,该方法需要微生物在同野外环境完全不同的溶液(B IOLO G微量板中是代谢活跃的,因此也不能期望它的结果反映了整个土壤区系的代谢情况6。但B IOLO G应用起来非常方便,适合大规模的野外分析。由于T2RFL P是建立在PCR2RFL P的基础之上,影响这些方法的因素同样限制了T2RFL P的应用,如DNA提取的代表性和完全性问题20以及PCR的扩增偏差等24。此外,解释T2RFL P的结果应当谨慎。比如物种丰富度的解释,在数量上不占优势的种的DNA模板在总DNA中占一小部分,很难检测到

28、这些种类使得种的多样性水平降低。另外,不同种的基因数量有差异,同一菌种的rRNA基因的序列差异在05%。因此即便是同一个种,产生的T2RFs差异也可能存在17。实际上,所有的分子生物学方法都受这些因素的影响。但比较起来,T2RFL P法分辨率相对要高,可以实现自动化,多态性分析只限于末端长度片段等,使得该方法具有较大应用优势。更重要的是,T2RFL P法可以和RDP数据库连接,充分利用了Internet数据资源共享的优势。可以预期,该方法将会在微生物生态学的研究中产生极大的推动作用。当然,在应用时应根据采集的土壤样品、保存时间、分析的目标要求等来决定采用何种方法。并通过适当的组合,将以上这些方

29、法有机结合起来,从不同的角度来解释所获得的数据,将会更加真实地反映自然土壤中微生物群体的区系结构。参考文献1东秀珠,洪俊华.2001.原核微生物的多样性J.生物多样性,9(1:1824.2陈晓蕾,张忠泽.1999.微生物的ARDRA检测J.微生物学杂志,9(4:4043.3杨永华,姚健.2000.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用J.生物多样性,8(3:337342.4崔雨新,王小明.1999.分子生物学技术在环境生物学中的应用J.自然杂志,21(5:295301.5Borneman J,et al.1996.Molecular microbial diversity of an agr

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