生化技术第五章

1、第五章第五章 基因重组与基因分析基因重组与基因分析第一节 核酸的分离纯化n 核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化，核酸样品质量将直接关系到实验的成败。n核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，要纯化核酸就必须去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，同时要保持所要提取核酸分子的结构和活性不被破坏。n核酸的性质：nDNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于

2、乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。核酸分离、纯化要保持核酸分子一级结构的完整性核酸分离、纯化要保持核酸分子一级结构的完整性n遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。n分离核酸要注意：n温度不要过高；n控制一定的pH值范围（pH值5-9）；n保持一定的离子强度；n减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。n防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制

3、剂。nDNA酶抑制剂n金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羟基喹啉；n阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。nRNA酶抑制剂酶抑制剂nRNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 n皂土。 皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。nDEPC（二乙基焦碳酸盐）。粘性液体，强核酸酶抑制剂n作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。n使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌

4、呤环。但浓度比使蛋白变性的浓度大1001000倍。容易降解，保存在4 或液氮中；提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。剧毒。核酸提取的过程与原理核酸提取的过程与原理n裂解细胞。n去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。n浓缩沉淀核酸。n纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质。n检测纯度与质量。n核酸的保存保存。n细胞的破碎细胞的破碎n细胞破碎的方法有：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法（SDS、吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。该过程要在低温下进行，并避免核酸

5、酶对核酸的水解。n核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除n核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。n核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种，针对所提核酸的种类，要选择合适的方法。常用方法：n加入浓盐溶液（如NaCl）。核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。n加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；n酚/

6、氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离（酚:氯:异戊醉=25:24:1）。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度大溶解度小溶解度小DNP 溶解度小（仅为水中溶解度小（仅为水中1%）溶解度大溶解度大 (比在水中大比在水中大2倍倍)n核酸的沉淀浓缩核酸的沉淀浓缩n核酸和蛋白质分离后，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯仿。接下来要浓缩核酸，沉淀是浓缩核酸最

7、常用的方法。n优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。n一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。n核酸的纯化n得到核酸沉淀后，还要要去除盐类，有机剂等杂质。通常是用乙醇洗涤，由于乙醇易挥发，最后只剩下比较纯的核酸。n核酸的浓度与纯度的测定核酸的浓度与纯度的测定A.紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定DNA和和RNA的含量的含量n前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 。n在波长260nm

8、紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37g/ml；RNA为40g/ml。n测测DNA：n纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。nOD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。n小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；nOD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。n可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。n测测RNAn纯RNA样品其OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，OD260 /OD230比值应大于2.0。n若RNA样

9、品OD260/OD280比值太小，有蛋白质或酚污染；n比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；nOD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。 溴乙锭荧光法测定核酸的含量n如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。此法的比较主要基于目测，是估计水平。 电泳检测核酸的含量和质量n通过电泳，可以观察所得核酸样品降解情况，也可以通过与标准Marker亮度比较来估计所得核酸含量。n核酸的保存核酸的保存nDNAnDNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；n长期保存样品中可加入一滴氯仿。nRNA nRNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (p

10、H5.2)或双蒸灭菌水中，-70保存；n长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中；n在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。 第二节第二节 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）n聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。nPCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。nMullis因其卓越

11、的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。nPCR的原理：的原理：n类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：n变性。加热模板使其解离成单链。n退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。n延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过3035个循环后，界于

12、两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106107倍。聚合酶链式反应（PCR）nPCR的原理：n这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过环的产物可作为下一次循环的模板，经过3035个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加复制，拷贝数约增加106107倍。倍。n典型典型PCR的反应体系：的反应体系：n耐热DNA聚合酶：n耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶 ，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶应

13、用最广泛。Taq酶在92.5、95和97.5时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95。Taq酶的最适温度是72 ，较高温度下的DNA合成错误率较低。因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR 走向自动化。n纯化的Taq DNA聚合酶有53外切酶活性，而无35外切酶活性，无校对活性。因此在PCR中每2104个核苷酸中有可能掺入一个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶。n在100L反应体系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5单位，酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度

14、过低则扩增产物量减少。Taq DNA酶可在-20贮存至少6个月。nPCR反应的缓冲液：反应的缓冲液：nPCR的缓冲液一般制成10，含有：500m mol/L KCl；100m mol/L Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2；0.1% 明胶。使用时要稀释10倍。n各组分的作用：nTris-HCl可维持反应体系的pH；nKCl有利于引物退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶活性；n明胶可保护酶不变性失活；nMg2+能影响Taq酶的活性，影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+浓度调至最佳。nPCR引物：引物：nPCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸

15、引物的正确设计。引物设计一般遵循以下原则：n引物长度。一般为15-30bp，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物 。nG+C含量。G+C含量一般为40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值应该协调，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值。n碱基的随机分布。引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现。引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合。两引物之间也不应有互补性，尤其是避免3端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降。n引物浓度。引物的浓度一般为0.1-0.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。

16、 ndNTP：ndNTP常用的浓度为20-200mol/L，而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误参入率，适当的低浓度会提高反应的精确度。另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合，应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。n模板模板DNA：n模板可以是基因组DNA、质粒DNA、扩增后的DNA、cDNA等，RNA的扩增需要首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA。n温度循环参数温度循环参数n变性温度一般为在90-95。变性所需的时间

17、取决于DNA的复杂性，一般用94、30s对模板DNA进行变性，过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。n引物退火温度通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般55-80 30s。延伸温度选在70-75之间，此时Taq酶活性最高。n延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定，一般1 kb以内延伸1 min，更长的片段需相应延长时间。nPCR的循环次数取决于模板DNA的浓度，一般20-30次。循环次数越多，非特异性产物也越多。 PCR技术的扩展技术的扩展n典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面 ，较常用的技术扩展有：1. “巢式”PCRn先用一

18、对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR。第一次扩增所用引物称外引物，第二次扩增作用的引物称内引物。n进行“巢式”PCR可将外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，用外引物进行时，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增。这种PCR技术被称为“中途进退式”PCR。n“巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量模板的扩增。2. 反转录反转录PCR（RT-PCR）nPCR由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为c

19、DNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR。RT-PCR常用于基因cDNA文库的构建和基因表达水平的分析。该技术需要用到反转录酶。 3. 荧光定量荧光定量PCR（RT-PCR）n通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。n萤光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。n荧光定量实时PCR的特点：n实时在线监控。对样品扩增的整个过程进行实时在线监控。对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，实时监控，能够实时

20、地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期。直观地看到反应的对数期。n降低反应的非特异性。使用引物和荧光探针降低反应的非特异性。使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高同时与模板特异性结合，提高PCR特异性。特异性。n增加定量的精确性。全程监控，准确定量。增加定量的精确性。全程监控，准确定量。n结果分析更加快捷方便，无需跑胶。结果分析更加快捷方便，无需跑胶。n基本原理：基本原理：n通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号 强度也等比

21、例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图n一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。n实时荧光定量PCR中荧光化学物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： nTaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的

22、荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。nSYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 第三节 核酸序列测定nDNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使

23、用DNA测序的方法进行测序。n在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。n目前应用最广泛的是：nSanger双脱氧链终止法。nMaxam-Gilbert DNA化学降解法。n新技术：杂交测序法， 质谱法， 单分子测序法， 原子探针显微镜测序法，DNA 芯片法 。Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法n基本原理：基本原理：n在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引

24、物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。n由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。nddNTPs 是反应终止剂，是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复可以当作正常碱基参与复制，一旦链入制，一旦链入DNA中，其中，其后就不能再继续连接。后就不能再继续连接。在自动测序中将荧光素连在4种ddNTP上Sanger双脱氧链终止法n基本步骤：n测序模板的纯化与定量n测序反应PCR仪n测序反应产物纯化与变性n上样电泳测序仪n分析结果Sanger双脱氧链终止法n测序结果：测序结果：Maxam-Gilb

25、ert DNA化学降解法化学降解法n基本原理：n在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。n因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。n每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。n鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质DNA相互作用。碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2

26、.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶B.Maxam-Gilbert DNA化学降解法n基本原理：n化学降解法与双脱氧法的比较化学降解法与双脱氧法的比较nMaxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些，通常说来，化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。n如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam-Gilbert化学降解法应用得更为广泛。但是，化学降解法具有一个Sanger 法所不具备的明显

27、优点：即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。n然而，由于Sanger法的简便快速，仍不失为现今DNA测序的最佳选择方案。第四节 基因重组与表达n基因重组是由于不同基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生链的断裂和连接而产生DNA片段的交片段的交换和重新组合，形成新换和重新组合，形成新DNA分子的过程。发生在生物体内的基因分子的过程。发生在生物体内的基因重组包括同源重组、位点特异重组、转座

28、作用和异常重组四大类，重组包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类，是生物遗传变异的一种机制。是生物遗传变异的一种机制。n本节所讲的基因重组是指基因克隆。是本节所讲的基因重组是指基因克隆。是70年代发展起来的一项具年代发展起来的一项具有革命性的研究技术。有革命性的研究技术。2022-2-2南京农业大学 生命科学学院44基因克隆的主要步骤1. 目的基因的获得目的基因的获得n基因组DNA的非特异性断裂n超声波处理基因组DNA可得到300bp左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能得到不同大小的DNA片段。由机械处理产生的DNA片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少

29、使用这种方法。n染色体DNA的限制性内切酶酶解n型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接。n内切酶识别的DNA顺序长短与降解后DNA产生的片段大小有直接关系。若识别顺序为4个碱性对，则该顺序在DNA链上出现的机率为44，即在碱基随机排列的前提下，每256个碱基对就有一个切点。对于识别6个核苷酸的限制性内切酶，其顺序出现的频率为46(4096)，可获得较大的DNA片段，也可用于DNA文库的建立。 n通过mRNA合成cDNAn基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整基因困难。利用RT-PCR得到

30、相应的双链cDNA，再进行克隆，获得较完整的连续编码顺序，容易在宿主细胞中表达。v人工体外合成DNA片段n一些小分子生物活性多肽，可以通过人工合成编码顺序插入载体后，转化细菌进行表达。分子较大的基因，可以通过分段合成，然后连接组装成完整的基因。v聚合酶链反应(PCR)扩增特定基因片段n对于有部分了解或完全清楚的基因，可以通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段，然后进行克隆操作。2. 载体载体n载体是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：n分子较小，可携带

31、比较大的片段。 n能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 n要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。 n有适合的标记，易于选择。 n有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 n从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。n载体的分类载体的分类n按功能可分为：按功能可分为：n克隆载体：克隆一个基因或DNA片断n表达载体： 用于一个基因的蛋白表达n整合载体：把一个基因插入到染色体组中n按来源可分为：按来源可分为：n质粒载体n噬菌体载体n柯斯质粒载体n真核细胞克隆载体质粒载体质粒载体n质粒是一种独立

32、于染色体外的小分子环状DNA，大小约106108 D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改造便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然 质粒经人工适当改造而成的， 目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。n两种质粒载体：n克隆的质粒载体。允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。n基因表达的质粒载体。允许外源DNA的插入、储存和表达。npBR322npBR322是由几个质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4363bp。具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。npBR322共有24种限制性内切酶的单一识别位点，其中

33、7种酶的识别位点位于四环素抗性基因内部，2种酶的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。n3种酶在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具单一的识别位点，在这3个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。n若将外源基因插入tetr基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌，则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。20世纪世纪70年代早期年代早期主要利用天然质粒主要利用天然质粒，1977年年Bolivar等等构建成功构建成功pBR322，1982年年Vi

34、era和和 Messsing构建成功构建成功pUC系列质粒，随系列质粒，随后有不少穿梭质粒后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世，表达质粒等问世。npUC18/pUC19npUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体，含有来自pBR322质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码肽链的基因，在lacZ基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。n当外源的DNA片段插入到这些克隆位点使互补链破坏时，形成的是无活性的-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在X-gal -IPTG培养基上形成白色菌落，而没有

35、外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在X-gal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。npUC质粒载体比pBR322具有更小的相对分子质量，更大的拷贝数（每个细胞可达500-700个拷贝），因此由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。pUC18和pUC19的唯一差别是多克隆位点的方向相反。nXgal可被可被-半乳糖苷酶水解生成深兰色的半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴溴-4-靛兰，靛兰，IPTG可诱导可诱导-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-链的合成。链的合成。 白色菌落：含外源DNA的转化菌落蓝色菌落：转化入空载体的菌落蓝白筛选噬菌体噬菌体n噬菌体的基因组是长度约为50kb的线性

36、双链DNA分子。在其两端，各有一条由12个核苷酸组成的互补粘性末端。当噬菌体DNA进入寄主细胞后，线性DNA分子通过粘性末端的碱基配对而结合，形成环状DNA分子。这种由粘性末端结合形成的双链区段为cos位点。n现用的噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：n插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点；n替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的DNA区段可被外源插入的DNA片段取代。n插入型载体只能插入较小的外源DNA片段（10kb），而替换型载体能插入较大的外源DNA片段（20-24kb左右）。当重组体DNA分子大于噬菌体基因组105%或小于75% 时，

37、重组噬菌体的活力会大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重组体DNA分子长度应控制在包装限度范围内。 n噬菌体重组体分子不具抗生素抗性选择标记，主要是依据噬菌斑的形态学特征和Xgal-IPTG显色反应来筛选重组子。ncI基因的存在将使噬菌体进入溶源状态，因此在培养基上形成的是混浊型的噬菌斑。cI基因失活或缺失 的噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑。根据这个形态学特征可筛选重组体分子。v 许多载体，含有编码半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位点）。由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑。当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就

38、会在Xgal-IPTG培养基上形成无色噬菌斑。柯斯质粒载体柯斯质粒载体ncosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。ncosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。n柯斯质粒载体的特点：n具有噬菌体的特性；n具有质粒载体的特性；n具有较高容量的克隆能力；n具有与同源性序列

39、的质粒进行重组的能力。酵母人工染色体(YAC)v 酵母人工染色体是一种真核细胞克隆载体。v YAC含有酵母染色体端粒、着丝点及复制起点等功能序列，可插入长度达200 - 500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具。M13噬菌体噬菌体nM13噬菌体是一种单链噬菌体载体。M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，具有长约6400bp的闭合环状单链(+)DNA，它只感染带有F因子所编码的性纤毛的大肠杆菌，所以是雄性大肠杆菌特有的噬菌性。M13(+)链DNA进入大肠杆菌寄主细胞后形成双链复制型DNA（RF DNA）。(-)链转录成M13的mRNA，并以滚

40、环复制合成M13(+)链DNA，并环化形成M13基因组。nM13是一种非溶菌的噬菌体，在实验中所观察到的混浊型噬菌斑，是由于感染的细菌生长速度比未感染的细菌明显下降所致。由于M13能以双链DNA形式存在于细胞中，并以单链DNA形式分泌到大肠杆菌以外，所以适合于在Sanger设计的双脱氧DNA序列分析中制备单链模板。n在M13系列中，部分载体中含有大肠杆菌lacZ序列，并可在此序列中导入多克隆位点，进行蓝白筛选。nM13噬菌体这类单链噬菌体载体的优越性：噬菌体这类单链噬菌体载体的优越性：n单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA；n不论是RF-

41、DNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；n单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制问题；n容易测定外源DNA片断的插入取向；n可产生含外源片断的单链DNA分子。n这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 工具酶工具酶n20世纪60年代末70年代初，科学家们陆续发现了DNA连接酶、限制性内切酶、反转录酶等一系列工具酶，为基因的剪切和基因片段与载体的链接等相应基因操作奠定了基础。这一类酶在重组DNA系统或基因工程操作中起着重要作用。n常用的工具酶有：n限制性内切酶主要

42、用于DNA分子的特异切割 n核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 n核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 n核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 n核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 限制性内切酶限制性内切酶n限制性内切核酸酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶。它们绝大多数是从微生物中分离出来的，根据酶的结构和功能特性，可分为I型、II型、III型三类。n 其中I型、III型类限制性核酸内切酶的识别位点和切割位点不同因此没有实际应用的价值。nII型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链，只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且

43、就在识别位点范围内切断DNA，是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。故通常所指都是II型限制性DNA内切酶，之后提到的限制性内切核酸酶均指II型限制性内切酶。n限制性内切酶根据种类不同可以产生5黏性末端、3黏性末端和平齐末端三种末端。DNA聚合酶聚合酶nDNA聚合酶是能够催化DNA 复制和修复DNA 分子损伤的一类酶，在基因工程操作中的许多步骤都是在DNA聚合酶催化下进行的DNA体外合成反应。n这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA 模板，也可作用于RNA 模板，但效率较低。最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：n大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）；n大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Kle

44、now片段）；nT4和T7噬菌体编码的DNA聚合酶；n经修饰的T7噬菌体 DNA 聚合酶（测序酶）；n耐热 DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶和 AmpliTaqTM）n有一种聚合酶，即反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶可优先拷贝RNA。n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n大肠杆菌DNA聚合酶是由大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽蛋白质，是一种多功能酶，具有三种酶活性：53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性。n切口平移反应：当双链DNA的一条链产生缺口时，DNA聚合酶的53聚合酶将脱氧核苷酸加添到3-OH 末端上，与此同时，其53核酸外切酶从缺口的5-P末端切

45、除原有核苷酸，使切口沿着DNA平移，此即称为切口平移反应，又称为缺口翻译。n在迄今已发现的所有聚合酶中只有大肠杆菌 DNA 聚合酶能够进行这种独立的链的取代反应，因为它具有53核酸外切酶活性，可以在聚合酶沿DNA链推进之前从DNA链上去除核苷酸。3.2. DNA聚合酶nKlenow 大片段酶大片段酶nDNA聚合酶可以被蛋白酶切割成两个片段，一个片段的分子质量较小，具有全部的53方向的核酸外切酶活性；另一个片段具有全部的53聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。n大肠杆菌DNA聚合酶大片段即Klenow大片段酶是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚合酶而产生出来的大片段分子，或者通过克隆技术而得到的

46、单一多肽链，由全酶中去除了53外切核酸酶活性，而53聚合酶活性及35核酸外切酶活性均不受影响。nKlenow片段的主要用途是：n补平限制酶切割DNA后产生的3凹端；n用32PdNTP对DNA片段的3凹端进行末端标记；n在cDNA克隆中，用于合成cDNA 第二链；n应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。nT4 DNA聚合酶聚合酶nT4 DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。同大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段相似，具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35外切酶活性。而且35外切活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强。nT7 DNA

47、聚合酶聚合酶nT7 DNA聚合酶是从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶,具有极高的连续合成能力(即高度续进性)，可以连续合成数千个核昔酸，是回前已知持续合成能力最强的DNA聚合酶。用于长模板DNA的引物延伸反应。nT7 DNA聚合酶经过适当化学处理可以使其失去35外切酶活性而转变为一种新的DNA聚合酶修饰的T7 DNA聚合酶。修饰的T7 DNA聚合酶由于失去了核酸外切酶活性，在单链模板上的聚合作用的速率增加了3倍，是双脱氧终止法对长片段DNA进行序列测定的理想用酶，并以测序酶作为商品名广泛使用。nTaq DNA聚合酶聚合酶nTaq DNA聚合酶是一种耐热的DNA

48、聚合酶，发现于水生栖热菌内，故简称Taq酶或Taq。Taq聚合酶在97.5C时的半衰期为9分钟。它的最适温度为75-80C，72C时能在10秒内复制一段1000bp的DNA片段。这种较高的酶活性有明显的温度依赖性。低温下，Taq DNA聚合酶表现活性明显降低，90C以上时合成DNA的能力有限。nTaq聚合酶常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。PCR反应中应用Taq聚合酶，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，大大降低了成本，PCR技术得以大量应用。n一般适用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物可直接用于T-A载体克隆。nTaq聚合酶的缺点之

49、一为催化DNA合成时的相对低保真性。它缺乏35核酸外切酶的即时校正机制，出错率为1/9000。n反转录酶反转录酶n反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。n反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3-OH末端上，按53方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。n反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，

50、目前它已成为一种重要的工具酶。常用于构建出cDNA文库，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。DNA连接酶连接酶nDNA连接酶是指能够催化两条链间磷酸二酯键的形成 ，用于将两段或数段 DNA连接起来的酶 。nDNA 连接酶所催化的 DNA 片段之间的连接本质上是一个酶促生物化学过程 。最常用的是来自大肠杆菌T4噬菌体的 T4 DNA连接酶和来自大肠杆菌染色体编码的大肠杆菌DNA 连接酶 ，两类酶的作用机制类似 。修饰酶修饰酶n在分子克隆中除了上述三类主要工具酶以外，还可以用一些其他的酶对DNA或RNA进行必要的修饰，以利于克隆的进行。如：n末端脱氧核苷酸转移酶

51、 可以催化一种或多种核苷酸连接到DNA片段的3羟基末端形成同聚尾，可以用于寡核着酸探针的末端标记；n多聚核苷酸激酶 可以催化人工合成的多核苷酸5羟基末端的磷酸化，为连接反应提供磷酸基团或用于寡核蓄酸探针的末端标记；n碱性磷酸酶 能特异地切除DNA或RNA的5末端的磷酸基团，防止载体DNA分子自身环化；n核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶 在重组DNA技术中用于消化去除RNA和DNA污染等。n碱性磷酸酶碱性磷酸酶n碱性磷酸酶有两种，分别来源于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫做细菌碱性磷酸酶，后者叫做小牛肠碱性磷酸酶。它们的共同特性是能够催化核酸脱掉5一磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5-P末端转换成5

52、-OH末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。n碱性磷酸酶的这种功能，对于DNA分子克隆是很有用的，可以防止线性化的载体分子发生自我连接作用。n末端转移酶末端转移酶n末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶。其在二价阳离子存在下，该酶能够催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。n与DNA聚合酶不同，在反应中末端转移酶不需要模板的存在就可以催化DNA分子发生聚合作用，而且它还是一种非特异性的酶，4种dNTP中的任何一种都可以作为它的前体物，但对不同的核着酸所需的阳离子略有不同。DNA分子的体外连接nDNA分子的连接方案要有利于重组子的形成，

53、有时需要对载体或目的基因的末端进行改造， 现时常用的连接方案主要有： 全同源黏性末端的连接v 若DNA插入片段与适当的载体存在同源黏性末端，则连接十分方便。但存在的问题是载体容易自身环化降低重组率，插入片段可双向插入或多拷贝插入，目的基因需表达时，需采用定向克隆技术。 平末端连接平末端连接nT4 DNA连接酶可连接平末端，5突出的黏性末端，可以用Klemow酶53聚合酶活力将另一链的3末端填平成平头末端。3突出的黏性末端可以用T4 DNA聚合酶的35外切酶删切成平头末端，平末端连接可以在DNA链的末端产生新的酶切位点，从而扩大了平末端连接的应用范围。n平末端连接的效率较低，易形成双向插入和多拷

54、贝插入，适当加大T4 DNA连接酶浓度，降低ATP浓度，载体5端脱磷酸处理，加入适量的PEG可提高连接效率。 定向克隆定向克隆n使外源DNA片段定向插入到载体分子中的方案叫定向克隆。定向克隆是利用DNA分子两个末端的不同内切酶位点进行的，对于一些表达型重组子，外源DNA片段在载体启动子下游的正向插入，是成功表达的基本条件。同时，定向克隆可有效地限制载体DNA自身环化。n定向插入要求载体DNA分子的两个末端不能互补，只能与外源DNA分子的相应末端连接，达到这一要求的DNA分子末端有两种形式：nDNA两端为非同源互补的黏性末端(黏-黏)。“黏-黏”末端可用不产生相同黏性末端的两种内切酶作用产生，重

55、组连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径。nDNA分子一侧为黏性末端，一侧为平末端(黏-平)。 利用连接子连接利用连接子连接n连接子的作用主要是在DNA平末端添加新的内切酶位点以产生黏性末端，便于DNA片段之间的连接，是亚克隆技术及基因文库构建中一项常用的技术。连接子大小一般为8-12bp，接受连接子的DNA片段必须是平末端，对于黏性末端则需预先修饰成平末端。n由于连接子的分子小，很容易达到DNA平末端连接所需的高末端浓度，一般连接子的末端浓度必须高于靶DNA末端浓度2-3倍。4-20mol/L连接子末端浓度，可以驱动T4 DNA连接酶的连接反应，因此靶DNA的浓度就可以较低。市售的连

56、接子有两种形式，即5末端磷酸化的连接子和5末端去磷酸化的连接子。前者能在T4 DNA连接酶催化下进行连接反应。后者需要用T4多核苷酸激酶在其5端磷酸化后，才能成为连接酶的合适底物。利用连接子连接利用连接子连接n使用连接子进行亚克隆操作包括三个步骤：2022-2-2南京农业大学 生命科学学院82v 将连接子连接于外源DNA片段两侧一平末端上 ；v 用相应的内切酶切割连接子；v 含新黏性末端的外源DNA片段与相应的载体DNA分子连接。 利用适配子连接利用适配子连接nDNA适配子是人工合成的寡聚脱氧核糖核苷酸链，它含有某种黏性末端的突出顺序，不需用内切酶切割而产生。通过与其它适配子或连接子互补配对，

57、形成双链DNA，再与靶DNA连接。在DNA重组中，可适用于各种类型的DNA末端之间的连接，且操作较使用连接子简单。n当今，由于适配子及连接子技术的发展，就重组技术而言，几乎不存在不能连接的DNA分子。 5. 重组子导入受体细胞重组子导入受体细胞n在基因克隆技术中，将重组质粒导入细菌称转化，将重组后的噬菌体、病毒等导入细胞称转导。n转化。受体菌用Ca2+处理后呈感受态，其细胞膜出现变化，使DNA易于进入细胞内。重组质粒与Ca2+处理过的感受态受体菌保温，重组体可进入受体菌。增加培养基降低Ca2+ 浓度，基因便可表达。质粒的转化率大约为105-107转化体/g DNA，一般较小的质粒转化率较高。用

58、电击法转化细菌操作简单，转化率可高达109-1010 /g DNA ，此法需特殊设备，且电压高，脉冲时间长时，细菌会有相当高的死亡率。n转导。重组噬菌体DNA进入经Ca2+处理的感受态细菌，转导率可达105-106噬菌斑/g DNA，若用噬菌体的外壳蛋白包装重组体，转导率还可大大提高。6. 重组子的筛选重组子的筛选n不同的克隆载体及相应的宿主系统，其重组子的筛选、鉴定方法不尽相同，常用的有以下几类。针对遗传表型改变的筛选法针对遗传表型改变的筛选法n重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因的表达失活，会导致细菌的某些表型改变，通过琼脂平板中添加一些相应筛选物质，可以直接筛选鉴别含重组子的菌

59、落。操作非常简单，是筛选阳性重组子的第一步。插入失活双抗生素对照筛选n如前述pBR322质粒，若外源DNA插入tetr基因，则先将转化菌接种到含氨苄青霉素的平板培养基上，凡生长的菌落均含有质粒。再用无菌牙签将这些菌落接种到含四环素平板培养基 的对应位置，凡不能生长者均含有重组质粒，扩大培养这些菌落，即可扩增重组质粒。 插入表达筛选n有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负控制序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。如pTR262质粒，其tetr基因上游存在Cl基因的负调控序列，CI基因可以抑制tetr基因的表达，当外源DNA片段插入CI基因时，tetr基因阻碍解除而表

60、达，阳性重组子为tetr表型，而质粒本身为tets表型，故在四环素平板中，只有含外源DNA插入片段的阳性重组的转化菌才能生长成菌落。-半乳糖苷酶系统筛选n通过插入失活lacZ基因的载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列等。共同点是载体上携带一段细菌的基因lacZ，它编码-半乳糖苷酶的部分，载体转化的宿主细胞为lacZM15 基因型，重组子中基因插入使-肽基因失活不能形成-互补作用，在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为无色噬菌斑或菌落，载体自身环化后转化的细菌为蓝色噬菌斑或菌落。这种筛选方式的操作非常简单，只是X-gal和IPTG等试剂价格较高。分析重组子结构特征的筛选法分析重组子结构特征的筛