生物药物检测技术

1、生物药物检测技术生物药物检测技术是指利用生物体（整体组织 ，离体组织微生物和细胞等）来测定药物的生物活性的一种方法。它以药物的药理为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，在一定条件下比较供试品和相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算，从而测得供试品的效价。本文主要介绍生物监测一些常用的方法。一般杂质检查 一、 氯化物检查法 氯化物检查法是利用氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银试液作用，生成氯化银的白色浑浊液，与一定量标难氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊液比较，以判断供试品中的氯化物是否超过了限量。除另有规定外，取各药品项下规定量的供试品，加水溶解使成25m1(

2、溶液如显碱性，可滴加硝酸使成中性)，再加稀硝酸10m1；溶液如不澄清，应滤过；置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，摇匀，即得供试溶液。另取各药品项下规定量的标准氯化钠溶液，置50m1纳氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水使成40ml，摇匀，即得对照溶液。于供试溶液与对照溶液中，分别加入硝酸银试液1.0ml，用水稀释至50ml，摇匀，在暗处放置5min，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，即得。 以上检查方法中使用的标难氯化钠溶液每lml相当于10g的Cl。在测定条件下，氯化物浓度以50ml中含5080g的Cl为宜，相当于标准氯化钠溶液58ml。在此范围内氯化物所显浑浊梯度明显，便

3、于比较。二、 硫酸盐检查法 微量的硫酸盐杂质，也是一种信号杂质。药物中微量的硫酸盐在稀盐酸酸性条件下与氯化钡反应，生成硫酸钡微粒显白色浑浊，与一定量标准硫酸钾溶液在相同条件下产生的硫酸钡浑浊程度比较，判定供试品硫酸盐是否符合限量规定。 检查方法： 取供试品，加水溶解成约40ml，置50ml纳氏比色管咖稀盐酸2ml，摇匀即得供试溶液；另取标准硫酸钾溶液，置50ml纳氏比色管中，加水使成约40ml，加稀盐酸2ml，摇匀即得对照溶液；于供试溶液与对照溶液中分别加入25%氯化钡溶液5ml，用水稀释成50ml，摇匀，放置10分钟，比浊。每1ml标准硫酸钾溶液相当于100g的SO4。 盐酸可防止碳酸钡或磷

4、酸钡等沉淀生成，影响比浊。但酸度过大可使硫酸钡溶解，降低检查灵敏度。50ml供试中含2ml稀盐酸为宜。三、 铁盐检查法 原理为铁盐在盐酸酸性溶液中与硫氰酸铵生成红包可溶性硫氰酸铁配位离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后所显的颜色进行比较。 取各药品项下规定量的供试品，加水溶解，使成25ml，移至50ml纳氏比色管中，加稀盐酸4m1与过硫酸铵50mg，加水稀释成35ml后，加30硫氰酸铵溶液3ml，再加水适量使成50ml，与标准铁溶液一定量按相同方法制成的对照溶液比较，来判断样品中铁盐的量是否超过限量。四、 重金属检查法 重金属系指在实验条件下能与硫代乙酰胺或硫代钠作用显色的金属杂质。生产中遇到

5、铅的机会较多，且铅又易在体内积蓄中毒，所以检查时以铅为代表。重金属影响药物的稳定性及安全性。一般采用以下四种方法： 1、Pb2+H2SPbS2H+（硫代乙酰胺法）：适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物，为最常用的方法。原理：硫代乙酰胺在弱酸性条件下水解，产生硫化氢，与重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液，与一定量标准铅溶液经同法处理后所呈颜色比较。适宜比色的范围为1020gPb/35ml，pH值对呈色影响较大。 医学教.育网搜集整理。 2、（有机破坏后检查法）：适用于含芳环、杂环以及不溶于水、稀酸及乙醇的有机药物。重金属可与芳环、杂环形成较牢固的价健，可先炽灼破坏，使重金属游离，再按第一法检查。

6、采用硫酸为有机破坏剂，温度在500600使完全灰化。所得残渣加硝酸进一步破坏，蒸干。加盐酸转化为易溶于水的氯化物，与对照试验比较。 3、（硫化钠法）：适用于溶于碱而不溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。以硫化钠为显色剂，Pb2+与S2-作用生成PbS微粒混悬液，与一定量标准铅溶液经同法处理后所呈颜色比较。硫化钠对玻璃有一定腐蚀性，应临用新制。 4、微孔滤膜法：适用于含25g重金属杂质及有色供试液的检查。重金属限量低时，用纳氏比色管难以观察，用微孔滤膜滤过，重金属硫化物沉集于滤膜形成色斑，与标准铅斑比较，可提高检查灵敏度五、砷盐检查法 砷盐是有毒的物质，多由药物生产过程所使用的无机试剂引入。砷盐

7、和重金属一样，在多种药物中要求检查。中国药典采用古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸银(简称Ag-DDC法)法检查药物中微量的砷盐。 六、 酸碱度检查法 检查药物中的酸碱性杂质。纯净原料药水溶液的pH值应是较为恒定的，但在工艺中经酸或碱处理的药物，如果控制不当，就会在产品中引入酸碱性杂质。酸碱性杂质的存在，可能影响药物的疗效或稳定性，因此，对在工艺中使用过酸或碱处理的药物，或对酸碱不稳定的药物，如酪类、酰胺类等，一股需进行酸碱度的检查。酸碱度检查所用的水应是新沸并放冷至室温的水。酸碱度检查的方法有以下几种：(1)酸碱滴定法酸碱滴定法是在一定指示剂的条件下，用酸或碱的滴定液(如盐酸滴定液或氢氧化钠滴定液

8、)滴定样品中的碱性或酸性杂质，用消耗滴定液的体积来控制酸碱性杂质量。 如氯化钠酸碱度检查的方法为：取本品0.50g，加水50ml溶解后，加溴麝香草酚蓝指示剂(pH6.07.6，黄色蓝色)2滴，如显黄色，加氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)0.10ml，应变为蓝色；如显蓝色或绿色，加盐酸滴定液(0.02mol/L)0.20ml，应变为黄色。(2)pH值法pH值法是通过测定一定浓度供试品溶液的pH值来控制药物中酸碱性杂质量的方法。常用于制备注射剂原料药中酸碱性杂质的控制。 如青霉素钠酸碱度的检查方法为：取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，依法测定，pH值应为5.07.0。(3)指示剂法指

9、示刑法是利用酸碱指示剂在不同pH条件下颜色的改变来检查酸碱性杂质的方法。如蒸馏水的酸碱度检查方法为：取供试品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色(pH值在4.4以上)：另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色(pH值在7.6以下)。七、 溶液颜色检查法 控制药品有色杂质限量的方法，是对通常利用紫外检测器进行有关物质高效液相色谱法测定的有效补充。有效杂质的来源一是由生产工艺中引入，二十在贮存过程中由于药品不稳定降解产生。一般有三种检测方法：目视法、紫外可见分光光度法和色差计法。 目视法：即将供试品溶液与各色调标准比色液进行比较，以判断结果。 紫外可见光光分度法 需要使用仪器紫外可见

10、分光光度计。 色差计法：本法是通过色差计直接测定药品溶液的透射三刺激值，求其颜色进行定量表述和分析的方法。当供试品溶液的颜色处于合格边缘，目视法难以准确判断时，以及供试品与标准比色液色调不一致时，更可显示本法的优越性。判定方法是直接将标准比色液和供试品溶液的三刺激值（或色品坐标值）进行比较，或通过标准比色液和供试品溶液分别与水的色差值进行比较。 八、 易炭化物检查法 易炭化物系指药品中夹杂的遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的有机杂质。于比色管中将一定量供试品分次缓缓加入5ml硫酸中，振摇溶解后，静置15分钟，溶液呈现的颜色与规定的对照液比较，不得更深。 九、 炽灼残渣检查法 检查不含金属的有机药物或

11、挥发性无机药物中混入非挥发性的无机杂质(金属氧化物或无机盐类)，炽灼残渣是经炽灼至完全灰化所残留的物质。 十、 干燥失重检查法 取供试品，混合均匀(如为较大的结晶,应先迅速捣碎使成2mm以下的小粒)。分取约1g或各药品项下所规定的重量，置与供试品同样条件下干燥至恒重的扁形称瓶中，精密称定，除另有规定外，照各药品项下规定的条件干燥至恒重。从减失的重量和取样量计算供试品的干燥失重。十一、水分测定法 共有4种方法，分别为烘干法、甲苯法、减压干燥法和气相色谱法。 烘干法：测定供试品在规定的条件下经干燥后所减失水分的重量，主要指水分，也包括其他挥发性物质。根据减失的重量和取样量计算供试品的含水量C%。本

12、法适用于不含或少含挥发性成分的品种。 甲苯法：测定供试品在甲苯加热回流条件下，被蒸馆出的水量，根据水量和取样量计算供试品的含水量。本法适用于含有挥发性成分的药品。 减压干燥法：测定供试品在规定的压力条件下干燥后所减失水分的重量，根据减失的重量和取样量计算供试品的含水量。本法适用于含有挥发性成分的贵重药品。 气相色谱法：以纯化水为对照，无水乙醇为溶剂，适用热导检测器，测定贵重药材及其制剂中的含水量。十二、可见异物检查法 可见异物是指存在于注射剂、滴眼剂中，在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常大于50m。可见异物检查法有灯检法和光散射法。一般常用灯检法，也可采用光散射法。特殊杂

13、质检查法 一、宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法 二、外源性脱氧核糖核酸残留量的检查法 三、鼠免疫球蛋白G残留量的检查法 四、产品相关杂质的检查法 五、残余抗生素的检查法 总体来说，由于药物品种不同，所含的特殊杂质不同（与不同药物的生产、贮存有关）。检查方法也不同，一般按药物和杂质在物理、化学性质上的差异，采用物理、化学方法检查。1.利用药物和杂质在物理性质上的差异 臭味和挥发性的差异、颜色差异、溶解行为差异、旋光性差异、对光吸收差形色谱差异等。 1）溶解行为的差异：如葡萄糖中检查糊精，葡萄糖在乙醇中加热溶解，糊精则不溶，规定应澄明。 2）对光吸收的差异：利用药物与杂质对Vis,，UV，IR

14、，原子吸收光谱的不同，进行检查。优点是灵敏度高，适用于微量物质的检查。3）吸附或分配性质的差异（色谱差异） （1）TLC:根据药物与杂质对吸附剂的吸附或展开剂的解析能力不同，加以分离和检查（2) HPLC法：利用HPLC法检查药物中的杂质。2,利用药物和杂质在化学性质上的差异 1酸碱性的差异：若有杂质，可用如下方法检查：规定消耗滴定液的体积；pH值测定法；指示剂法。 2氧化还原性质的差异：利用药物与杂质氧化还原电位的差异进行检查，如氯化物中碘化物或溴化物的检查。3杂质与一定的试剂反应产生沉淀：如生物碱中其他生物碱的检查，多采用此法。 4杂质与一定的试剂反应产生颜色：利用药物中的杂质与某些试剂发

15、生氧化、络合、偶合等显色反应，进行药物中杂质的鉴别。5杂质与一定的试剂反应产生气体：利用此法可检查药物中的砷、硫、碳酸盐、氨盐、氰化物等。例如氰化物的检查中国药典采用：改进普鲁士蓝法；气体扩散-三硝基苯酚锂法。 6药物经有机破坏后检查杂质：硒的检查；氟的检查。安全性检查法 一、 热原检查法 本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38的供试品溶液，然后每隔1小时按前法测量其体温1次,共测3次,以3次体温中最高的一次减去正常体温，

16、即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6或0.6以上,或3只家兔体温升高均低于0.6,但升高的总数达1.4或1.4以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。二、 细菌内毒素检查法 本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 取装有0.1ml鲎试剂溶液的1075mm试管（或0.1ml支规格的鲎试剂原安瓿）4支，其中2支加入0.1ml供试品作为供试品管，1支加入2内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管,1支加入细菌内毒素检查用水0.1ml作为阴性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口

17、，垂直放入371水浴中，保温602分钟。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。三、 异常毒性及特异性毒性检查法 本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在规定时间内观察小鼠死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。四、 降压物质检查法 本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。五、 过敏反应检查法 本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行攻击，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。无菌检查法 无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的 其他品种是否无菌的一种方法。 无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作,防 止微生物污染。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验证。微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括细菌数、霉