第一节核酸的分离纯化ppt课件

1、 分子生物学研讨之所以从20世纪中叶开场得到高速开展，其中最主要的缘由就是现代分子生物学研讨方法、特别是基因操作和基因工程技术的提高。DNA分子的切割与衔接分子的切割与衔接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因操作基因操作基因的定点突变基因的定点突变PCR扩增等扩增等中心技术中心技术1、实际上的三大成就2、技术上的二大发明三大成就三大成就 ：1. 401. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，处理了遗传而不是蛋白质，处理了遗传的物质根底

2、问题；的物质根底问题；1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae1952年年Hershey和和Chase证明噬菌体证明噬菌体DNA侵染细菌实验侵染细菌实验2. 502. 50年代提示了年代提示了DNADNA分子的双螺旋构造模型和半分子的双螺旋构造模型和半 保管复制机制保管复制机制, ,处理了基因的自我复制和世代交处理了基因的自我复制和世代交替问题；替问题；X-ray sourceCrystallized DNARosalind Franklin拍出拍出 了第一

3、张了第一张能反映能反映DNA美丽双螺旋构造的美丽双螺旋构造的X射线照片射线照片 Maurice WilkinsPhotographicfilmDescription of the 3-D structure of DNAFrancis Crick & James Watson三位科学家由于对这一 成果的奉献，共享1962年的诺贝尔生物学奖 Conservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication3. 503. 50年代末至年

4、代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了 中心法那么中心法那么 和和支配子学说支配子学说, ,胜利地破译了遗传密码，充分认识了遗胜利地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。传信息的流动和表达。Jacob and Monod但是，假设没有分别和富集单但是，假设没有分别和富集单一一DNADNA分子的技术，科学家就无分子的技术，科学家就无法对这类物质进展直接的生化法对这类物质进展直接的生化分析。分析。 两大技术保证：两大技术保证：1.DNA1.DNA的体外切割和衔接的体外切割和衔接19621962年年Arber Arber 发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，1967Gell

5、ert1967Gellert发现了发现了 DNA DNA 衔接酶衔接酶DNA ligase DNA ligase Herbert Boyer,Herbert Boyer,Stanley CohenStanley Cohen19721972年获得第一年获得第一个重组个重组DNADNA分子分子( (实现不同来源实现不同来源DNADNA的重组的重组) )Herbert BoyerProduced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky e

6、ndSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNATransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells pla

7、ted onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies2.DNA2.DNA的核苷酸序列分析技术的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的根核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的根底上创建并发站起来的一门重要的底上创建并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，技术学，这门技术，对于从分子程度上研讨基因的构造与功能的关系，以及克隆对于从分子程度上研讨基因的构造与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方

8、面，都有着非常广泛的运用价值。片断的操作方面，都有着非常广泛的运用价值。General process of gene engineering1. 从生物有机体基因组中，分别出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段衔接到可以自我复制的并具有选择记号的载体分子上，构成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞亦称寄主细胞并与之一同增殖。4. 从大量的细胞繁衍群体中，挑选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并挑选出曾经得到扩增的目的基因。5. 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实

9、现功能表达，研讨核酸序列与蛋白质功能新的遗传背景下实现功能表达，研讨核酸序列与蛋白质功能之间的关系。之间的关系。 前言前言一、核酸分别、纯化原那么一、核酸分别、纯化原那么一坚持核酸分子一级构造的完好性一坚持核酸分子一级构造的完好性二防止核酸的生物降解二防止核酸的生物降解二、分别提取核酸的主要步骤二、分别提取核酸的主要步骤一细胞的破碎一细胞的破碎二核蛋白的解聚、变性蛋白的去除二核蛋白的解聚、变性蛋白的去除三核酸的沉淀三核酸的沉淀 ( (四核酸的浓度测定四核酸的浓度测定五核酸的保管五核酸的保管 核酸核酸nucleic acidnucleic acid是遗传信息的携是遗传信息的携带者，是基因表达的物

10、质根底。带者，是基因表达的物质根底。 无论是进展核酸构造还是功能研讨，首先无论是进展核酸构造还是功能研讨，首先需求对核酸进展分别和纯化。需求对核酸进展分别和纯化。 核酸样质量量将直接关系到实验的成败。核酸样质量量将直接关系到实验的成败。前前 言言Home一坚持核酸分子一级构造的完好性一坚持核酸分子一级构造的完好性 1 1 意义意义 遗传信息全部储存在一级构造之中，核酸遗传信息全部储存在一级构造之中，核酸的的级构造还决议其高级构造的方式以及和其级构造还决议其高级构造的方式以及和其他生物大分子结合的方式。他生物大分子结合的方式。 2 2 分别核酸原那么：分别核酸原那么： 1 1温度不要过高；温度不

11、要过高； 2 2控制一定的控制一定的pHpH值范围值范围(pH(pH值值5-9); 5-9); 3 3坚持一定的离子强度坚持一定的离子强度; ; 4 4减少物理要素对核酸降解的机械剪切力减少物理要素对核酸降解的机械剪切力. .Home 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级构造。中的磷酸二酯键，破坏核酸一级构造。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。冲液中需加核酸酶抑制剂。1 1 金属离子螯合剂：金属离子螯合剂： DNADNA酶需求金属二价离子酶需求金属二价离子Mg2+Mg

12、2+、Ca2+Ca2+的激活，的激活，因此运用金属二价离子螯合剂，可抑制因此运用金属二价离子螯合剂，可抑制DNADNA酶活酶活性。如性。如EDTA-Na2(EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠) )、8-8-羟基喹羟基喹啉；啉；2 2 阴离于型外表活性剂：阴离于型外表活性剂： 如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制造用外，还，该试剂除对核酸酶有抑制造用外，还能使蛋白量变性，并与变性蛋白结合成带负电荷能使蛋白量变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 RNAase分布广泛，极易污染样品，而分布广泛，极易污染样品，而且

13、耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土皂土bentonite 作用机制：皂土带负电荷，能吸附作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。 运用留意：运用留意： 1DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白量变性的浓度大但浓度比使蛋白量变性的浓度大1001000倍。倍。

14、 2容易降解，保管在容易降解，保管在4 或液氮中；或液氮中； 3提提RNA时，时，0.1% DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。 4剧毒。剧毒。3) 3) 肝素肝素4 4复合硅酸盐复合硅酸盐Macaloid)Macaloid)5 5RNaseRNase阻抑蛋白阻抑蛋白RNasinRNasin6 6氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)Ribonucleoside Complex, VRC)Home一细胞的破碎一细胞的破碎 1 1 高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎 2 2 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀

15、浆 3 3 超声波处置法超声波处置法 4 4 液氮研磨法液氮研磨法 5 5 化学处置法化学处置法(SDS(SDS、LDSLDS，吐温，吐温8080等等 6 6 生化法溶菌酶、纤维素酶等生化法溶菌酶、纤维素酶等Home二核蛋白的解聚、变性蛋白的去除二核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力吸力( (核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合) )、氢键和非、氢键和非极性的范德华力。极性的范德华力。 分别核酸最困难的是将与核酸严密结合分别核酸最困难的是将与核酸严密结合的蛋白质分开，同时防止核酸降解。的蛋白质分开，同时防止核酸降解。 常用方

16、法：常用方法： 1 参与浓盐溶液如参与浓盐溶液如NaCl 核酸核酸-蛋白质参与蛋白质参与NaCl后，破坏静电吸后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2 参与参与SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；功能； 3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合运用能添加去除蛋白的效酚氯仿混合运用能添加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制造用。果，并对核酸酶有抑制造用。 氯仿比艰苦，能加速有机相与水相分层，氯仿比艰苦，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去

17、减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。除植物色素和蔗糖的作用。 在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需求振摇，氯仿抽提核酸提取液时，需求振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分别，为防止起泡和促使水相与有机相的分别，再加上一定量的异戊醇酚：氯：异戊醉再加上一定量的异戊醇酚：氯：异戊醉=25：24：1。 1 1运用留意运用留意 酚通常是透明无色的结晶，假设酚结晶呈现粉酚通常是透明无色的结晶，假设酚结晶呈现粉红色或黄色，阐明其中含有酚的氧化产物，例如红色或黄色，阐明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，由于氧化

18、物可破坏核酸的磷酸二酯键。由于氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2 2平安操作平安操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。应戴手套。运用酚时应留意运用酚时应留意Home 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：优点： 改动核酸的溶解缓冲液；改动核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L) 终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac

19、102.5NaCl50.2LiCl80.8 1 1乙醇乙醇优点：优点： 对盐类沉淀少，沉淀中对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。不影响以后实验。缺陷：缺陷： 需求量大，普通要求需求量大，普通要求低温操作。低温操作。优点：优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。普通不需低温长时间放置。样品沉淀。普通不需低温长时间放置。缺陷：缺陷： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用发除去。所以，最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次

20、。优点：优点： 可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段。运用片段。运用60006000相对分子质量的相对分子质量的PEGPEG进展进展DNADNA沉淀时，运用浓度与沉淀时，运用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。留意：留意： PEGPEG沉淀普通需求参与沉淀普通需求参与0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10mmol/L10mmol/L的的MgCl2MgCl2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA

21、DNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中构造凝在溶液中构造凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与杂质与DNADNA分开，到达纯化分开，到达纯化DNADNA的目的。的目的。 普通强调，核酸沉淀在低温长时间下进展。普通强调，核酸沉淀在低温长时间下进展。低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀，共沉淀，影响以后的实验。普通运用影响以后的实验。普通运用00冰水，冰水，10-10-15min15min， DNADNA样品足可到达实验要求。样品足可到达实验要求。Home 1 1 紫外

22、分光光度法测定紫外分光光度法测定DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于大于0.25 g/ml 0.25 g/ml 。 结论：在波长结论：在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的值的吸光度相当于双链吸光度相当于双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单；单链链DNADNA为为37 g/ml37 g/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。 DNA或RNA链上碱基的苯环构造在紫光区具有较强吸收

23、，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差别。 对规范样品来说，浓度为1g / ml时，DNA钠盐的OD2600.02当OD2601时，dsDNA浓度约为50g / ml ssDNA浓度约为37g / ml RNA浓度约为40g / ml原理：核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰OD260/OD2801.7OD260/OD2302.01 OD260=50 g/mL DNAa a汲取一定量的汲取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加水至特定体积样品，加水

24、至特定体积 后，转入分光光度计的石英比色杯中。后，转入分光光度计的石英比色杯中。b b分光光度计先用一定量的水校正零点。分光光度计先用一定量的水校正零点。c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。 双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD260(g/l) = OD260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50/1000 50/1000； RNARNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD260(g/l) = OD260核酸核酸稀释倍数稀释倍数40/100040/1000。e e分析纯度。

25、分析纯度。A：测：测DNA： 纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1) OD260/OD280大于大于1.9时，阐明有时，阐明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6时，阐明样品中存在蛋白质或酚污染；时，阐明样品中存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0时，阐明溶液中有残存时，阐明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注： 能够出现既含蛋白质又含能够出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液溶液比值为比值为1.8的情况。的情况。 测定结果分析测定结果分析B B：测：测RNARNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-1.7-2.02.0之间，之间，OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1假设假设RNARNA样品样品OD260/OD28