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文档简介

1、细胞培养总结Cell Culture细胞生物学细胞生物学教研室教研室一、细胞培养技术回顾一、细胞培养技术回顾(一)细胞培养所用制品的清洗与消毒(一)细胞培养所用制品的清洗与消毒在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,这些在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,这些物质若有残留,会影响培养细胞的生长物质若有残留,会影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物 上次细胞残留物上次细胞残留物 非营养成分的化学非营养成分的化学物质物质需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗胶塞的清洗 塑料制品的清洗塑料制品的清洗(二)细胞培养(

2、二)细胞培养常用试剂常用试剂 细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水 1:水:水2 2:细胞培养基:细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基常用的培养基种类常用的培养基种类 RPMI-1640、高糖、高糖DMEM、低糖、低糖DMEM、F12 等等细胞培养基应用选择细胞培养基应用选择 选择培养基没有一定的标准,有几点建议可供参考:选择培养基没有一定的标准,有几点建议可供参考: 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培

3、养基。可建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询。以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试,许多培养基可以适合多种细胞。其它实验室惯用的培养基不妨一试,许多培养基可以适合多种细胞。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。 用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的落形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基,这是最客观的方法,

4、但比较繁琐方法,但比较繁琐。 3:血清:血清 热灭活:热灭活:56, 30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的:灭活血清中的补体成分。热灭活目的:灭活血清中的补体成分。 适用于细胞因子和免疫相关实验,否则建议血清不要灭活。因为热处适用于细胞因子和免疫相关实验,否则建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,还会影响血清的质量。灭活后有时会严理会造成血清沉淀物显著增多,还会影响血清的质量。灭活后有时会严重影响细胞生长速度,且细胞贴壁率降低。重影响细胞生长速度,且细胞贴壁率降低。 血清中的沉淀物血清中的沉淀物 絮状物:絮状物:血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维

5、蛋白造成,这些絮血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 分钟去除,也分钟去除,也可不用处理;可不用处理; 显微镜下显微镜下“小黑点小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。多。有些沉淀物在显微镜下观察象有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点”,常误认为血清受污染,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量,。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。则

6、应立即停止使用,更换另一批号的血清。4: 平衡平衡盐液体盐液体 组织细胞培养中常用的基本液体,可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体,可以维持渗透压、调节pHpH值值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等KCl0.40 gKH2PO40.06 gNaCl8.00 gNa2CO30.35 gNa2HPO40.048 gD-Glucose1.00 gPhenol Red0.01 gD-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)PBS(Ph

7、osphate-Buffered Sallines) KCl0.20g KH2PO4 0.20g NaCl8.00g Na2HPO47H2O2.16gDPBS(Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines)标准型)标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙)0.10 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gMgCl26H2O0.10 gNaCl8.00 gNa2HPO47H2O2.16 g5:消化液:消化液 分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液两种溶液 单独或

8、混合使用单独或混合使用6:pH 调整液调整液 NaHCO3 溶液溶液 常用浓度为常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后,过滤除菌或高压灭菌,。配制时用三蒸水溶解后,过滤除菌或高压灭菌,分装,分装,4保存保存 HEPES(分子量(分子量238.31)溶液)溶液 羟乙基哌秦乙硫磺酸,一种弱酸,无细胞毒性羟乙基哌秦乙硫磺酸,一种弱酸,无细胞毒性 主要作用:防止培养基主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了胞时培养基脱离了5%CO2的环境,的环境,CO2气体迅速逸出,气体迅速逸出,pH迅速升高迅速升高,若加了,若加了HEPES,

9、此时可以维持,此时可以维持pH7.0左右。左右。HEPES配制配制 使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-50 mmol/L 常配成常配成1M 储存液:用储存液:用20 ml 双蒸水溶解双蒸水溶解4.76克克HEPES,过滤除菌或,过滤除菌或高压灭菌,分装小瓶,高压灭菌,分装小瓶,4保存。保存。 使用时可向使用时可向100 ml培养液中加入培养液中加入2ml HEPES储存液,终浓度为储存液,终浓度为20 mmol/L 7:谷氨酰胺:谷氨酰胺补充液补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很

10、不稳定容易降解,谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4下放置下放置7天即可分解约天即可分解约50%,所以都是在使用前添加所以都是在使用前添加配制好的培养液(含谷氨酰胺)在配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4放置放置2周以上时,要重新加入原来周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,临用前加入培养液中;量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,临用前加入培养液中;使用终浓度为使用终浓度为1 4 mmol/L配制方法配制方法:一般配制为一般配制为100倍储存液,浓度倍储存液,浓度200 mmol/L(29.22 g/L)谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml即配成

11、即配成200 mmol/L的溶液,充分的溶液,充分搅拌溶解后(应加温搅拌溶解后(应加温30),过滤除菌,分装,),过滤除菌,分装,-20保存;保存;使用时向使用时向100 ml培养液中加入培养液中加入0.5 2 ml储存液,终浓度为储存液,终浓度为1 4 mmol/L 8:酚红:酚红 大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH 指示指示 橙红色表示中性橙红色表示中性pH,黄色代表酸性,黄色代表酸性pH,紫红色表示碱性紫红色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明:酚红能模拟类固因为已有一些研究表明:酚红能模拟类固醇激素(尤其是雌激素

12、)样作用醇激素(尤其是雌激素)样作用9:抗生素:抗生素溶液溶液抗生素使用种类与浓度抗生素使用种类与浓度: 工作浓度工作浓度 储存温度储存温度 杀灭细菌杀灭细菌 penicillin (青霉素青霉素) 100 U/ml -20 G(+) streptomycin (链霉素链霉素) 100 ug/ml -20 G(+) , G(-) gentamicin (庆大霉素庆大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) , G(-), 支原体支原体amphotericin B (两性霉素两性霉素B) 2.5 ug/ml -20 真菌真菌nystatin (制霉菌素制霉菌素) 50 ug/ml -20 真菌

13、真菌(三)、器材(三)、器材和液体的准备和液体的准备 细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后,装在铝盒和铁筒培养瓶、吸管等在清洗干净以后,装在铝盒和铁筒中,中,160160,2 2小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用 手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的PBSPBS液液 1515磅,磅,121121,2020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌 培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液 抽滤后备用抽滤后备用 冷冻保存细胞的解冻与复苏要点 快速解冻快速解冻冻存细胞从液氮中取出后,立即放入冻存细胞从液氮中取出后,立即放入37水浴中,轻轻摇动水浴中,轻轻摇动冷

14、冻管,使其在冷冻管,使其在1 分钟内全部融化(不要超过分钟内全部融化(不要超过3 分钟);分钟);用用80g 离心离心23 分钟,弃上清液;分钟,弃上清液;用用510 ml 新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞;细胞;接种细胞到培养瓶中,起始密度为接种细胞到培养瓶中,起始密度为3105/ml;24 小时后去除未贴壁的细胞,常规培养。小时后去除未贴壁的细胞,常规培养。二、细胞的原代和传代培养原代培养原代培养1.植块法培养植块法培养原代培养原代培养2. 酶酶解解组织组织消化、接种培养消化、接种培养原代细胞植块培养原代细胞植块培养 细胞接种后一般几小时

15、内就能贴壁,并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长 如接种的细胞密度适宜,如接种的细胞密度适宜,5 5天到一周即可形成单天到一周即可形成单层层贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代方法方法传代细胞培养结果传代传代细胞培养细胞培养二、细胞增殖检测(一)、细胞(一)、细胞计数及活力测定计数及活力测定 。 计数四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,分别数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中死细胞和活细胞数。 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度 细胞悬液的细胞数细胞悬液的细胞数/ml/ml (四个大格子细胞数(四个

16、大格子细胞数/4/4)稀稀释倍数释倍数10104 4公式中说明: 除以4表示4个大格的细胞数平均; 乘以104因为计数板中每个大格体积:长1.0mm宽1.0mm高0.1mm0.1mm3; (1ml103 mm3) 细胞台盼蓝染色计数和活力测定的实验结果细胞台盼蓝染色计数和活力测定的实验结果(二)、(二)、CCK8 实验结果实验结果Raw DataRaw DataA1A12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212B B 0.2330.2330.0880.0880.2610.2610.1450.1450.3580.3580.1140.1140.2680.2680.11

17、70.1170.0050.0050.0030.003C C0.2570.2570.10.10.280.280.1230.1230.4430.4430.1140.1140.2810.2810.1290.1290.0050.0050.0040.004D D0.2470.2470.1740.1740.2840.2840.1110.1110.3570.3570.1130.1130.2580.2580.1420.1420.010.010.0060.006E E0.2750.2750.1290.1290.3220.3220.1310.1310.3070.3070.1450.1450.3040.3040.1

18、380.1380.0110.0110.010.01F F0.2590.2590.1260.1260.3370.3370.1220.1220.2950.2950.1290.1290.2830.2830.1270.1270.010.010.0110.011G G0.2650.2650.110.110.2990.2990.0770.0770.2850.2850.1140.1140.2720.2720.120.120.0090.0090.0090.009H HBlanked DataBlanked DataA1A12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212B B 0.22

19、530.2253 0.08030.0803 0.25330.2533 0.13730.1373 0.35030.3503 0.10630.1063 0.26030.2603 0.10930.1093 -0.003-0.003 -0.005-0.005C C0.24930.2493 0.09230.0923 0.27230.2723 0.11530.1153 0.43530.4353 0.10630.1063 0.27330.2733 0.12130.1213 -0.003-0.003 -0.004-0.004D D0.23930.2393 0.16630.1663 0.27630.2763 0

20、.10330.1033 0.34930.3493 0.10530.1053 0.25030.2503 0.13430.1343 0.00230.0023 -0.002-0.002E E0.26730.2673 0.12130.1213 0.31430.3143 0.12330.1233 0.29930.2993 0.13730.1373 0.29630.2963 0.13030.1303 0.00330.0033 0.00230.0023F F0.25130.2513 0.11830.1183 0.32930.3293 0.11430.1143 0.28730.2873 0.12130.121

21、3 0.27530.2753 0.11930.1193 0.00230.0023 0.00330.0033G G0.25730.2573 0.10230.1023 0.29130.2913 0.06930.0693 0.27730.2773 0.10630.1063 0.26430.2643 0.11230.1123 0.00130.0013 0.00130.0013H H均数均数0.2480.248 0.1130.113 0.2890.2890.110.11 0.3330.333 0.1140.1140.270.27 0.1210.121 6E-046E-04-0-0112345678910

22、1112A0.182 0.066 0.049 0.0490.050.050.050.051 0.052 0.051 0.052 0.051 450B0.051 2.526 2.623 2.631 2.681 2.709 2.653 2.608 2.841 0.051 0.0510.05 450C0.052.4982.62.545 2.565 2.521 2.598 2.466 2.449 0.051 0.051 0.049 450D0.051 2.632 2.681 2.681 2.611 2.484 2.438 2.545 2.502 0.061 0.052 0.057 450E0.051

23、2.652 2.661 2.617 2.448 2.579 2.641 2.6652.620.050.051 0.049 450F0.052.6252.642.566 2.597 2.618 2.732 2.821 2.4740.050.050.05 450G0.051 2.736 2.6312.632.7242.812.818 2.8682.830.049 0.051 0.051 450H0.050.051 0.054 0.052 0.0550.050.050.055 0.052 0.049 0.049 0.049 4501-11-11-21-24-14-14-24-22-12-12-22-

24、23-13-13-23-22.344 2.441 2.449 2.499 2.527 2.471 2.426 2.6592.316 2.418 2.363 2.383 2.339 2.416 2.284 2.2672.45 2.499 2.499 2.429 2.302 2.256 2.3632.322.47 2.479 2.435 2.266 2.397 2.459 2.483 2.4382.443 2.458 2.384 2.415 2.4362.55 2.639 2.2922.554 2.449 2.448 2.542 2.628 2.636 2.686 2.64821234567101

25、112A0.2150.0420.053 0.043 0.042 0.042 0.041 0.042 0.043 0.042 450B0.0421.9792.153 2.264 2.337 2.407 2.336 2.509 2.454 0.042 450C0.0422.0852.165 2.281 2.389 2.257 2.534 2.359 2.4510.04 450D0.0452.0961.845 2.498 2.445 2.423 2.455 2.527 2.429 0.042 450E0.072.261.528 2.383 2.405 1.851 2.146 2.393 2.387

26、0.044 450F0.0412.221.6672.462.31.469 2.277 2.374 2.413 0.043 450G0.0452.3231.872.538 2.304 1.703 2.381 2.425 2.212 0.053 450H0.0420.0440.044 0.0460.040.043 0.042 0.041 0.044 0.043 4506-16-16-26-27-17-17-27-28-18-18-28-25-15-15-25-21.764 1.938 2.049 2.122 2.192 2.121 2.294 2.2391.871.95 2.066 2.174 2

27、.042 2.319 2.144 2.2361.8811.63 2.2832.23 2.2082.24 2.312 2.2142.045 1.313 2.1682.19 1.636 1.931 2.178 2.1722.005 1.452 2.245 2.085 1.254 2.062 2.159 2.1982.108 1.655 2.323 2.089 1.488 2.1662.21 1.997(三)、流式细胞仪(三)、流式细胞仪测定测定细胞周期细胞周期(四)、细胞分裂指数测定(四)、细胞分裂指数测定(五)、(五)、EDU或或BRDU标记实验标记实验二、细胞运动检测(一)、细胞划痕实验(一)

28、、细胞划痕实验(二)、(二)、TRANS-WELL实验实验1(二)、(二)、TRANS-WELL实验实验2二、细胞凋亡检测Channels (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/10/25 Liu.001Date analyzed: 25-Oct-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 49.24 % at 78.49 Dip G2: 19.45 % at 152.54 Dip S: 31

29、.31 % G2/G1: 1.94 %CV: 6.87Total S-Phase: 31.31 %Total B.A.D.: 0.14 % no aggsApoptosis: 2.12 % Mean: 57.30Debris: 1.21 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 7462All cycle events: 7216Cycle events per channel: 96RCS: 5.089DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SLiu Mei(#S10 0 48h)FL2-A-FL2-A0306090120R1Channels

30、 (FL2-A-FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed: 2004/11/1 Yao.003Date analyzed: 1-Nov-2004Model: 1Dn0A_DSFAnalysis type: Manual analysisDiploid: 100.00 % Dip G1: 49.48 % at 78.74 Dip G2: 23.33 % at 158.63 Dip S: 27.19 % G2/G1: 2.01 %CV: 7.51Total S-Phase: 27.19 %Total B.A.D.: 7.77 % n

31、o aggsApoptosis: 1.32 % Mean: 44.33Debris: 17.82 %Aggregates: 0.00 %Modeled events: 6655All cycle events: 5397Cycle events per channel: 67RCS: 6.019DebrisApoptosisDip G1Dip G2Dip SLiu Mei(#S10 12h 4mg)FL2-A-FL2-A0306090120R1流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡三、真核细胞转染Transfection of eukaryotic cellsTransfection W

32、hat is Transfection?Transfection is a method of transporting DNA, RNA and/or various macromolecules into an eukaryotic cell by using chemical, lipid or physical based methods. Methods: (just a few examples) Method Application CaPO4, DEAE DNA Transfection Liposome Based DNA Transfection Polyamine Bas

33、ed DNA TransfectionPurpose/uses of Transfection Study gene function Study protein expression Transfer DNA into embryonic stem cellsHow it works Utilize Chemical, lipid or physical methods (direct microinjection, electroporation, biolistic particle delivery) for transportation of genetic materials or

34、 macromolecules.How it works Chemical and lipid methods Neutralize negative charges on DNA Chemical method: Calcium phosphate; creates precipitates that settle on cells and are taken in. Lipid or Polymer methods: interact with DNA, promotes binding to cells and uptake via endocytosis.How it works Ph

35、ysical methods Electroporation: use of high voltage to deliver nucleic acids; pores are formed on cell membrane. Direct Microinjection: Use of a fine needle. Has been used for transfer of DNA into embryonic stem cells. Biolistic Particle delivery: Uses high-velocity for delivery of nucleic acids and

36、 penetration of cell wall.Experimental method/process(chemical methods)HBS = HEPES-Buffered SalineAdvantages/Disadvantages Advantages:Provides the ability to transfer in negatively charged molecules into cells with a negatively charged membrane.Liposome-mediated transport of DNA has high efficiency.

37、 Good for long-term studies requiring incorporation of genetic material into the chromosome. Disadvantages:Chemical Reagents: not useful for long-term studies.Transfection efficiency is dependent on cell health, DNA quality, DNA quantity, confluency (40-80%)Direct Microinjection and Biolistic Partic

38、le delivery is an expensive and at times a difficult method.脂质体转染绿色荧光蛋白质粒结果Invitrogen阳离子脂质体转染指南脂质体转染绿色荧光蛋白融合的目标基因表达定位在胞质四、流式细胞术Injector TipSheath fluidFlow cytometry流式细胞术(流式细胞术(Flow Cytometry, 简称简称FCM)FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.) FL2FL1SSCFSCFL4FL3基因转染细胞的分选基因转染细胞

39、的分选绿色萤光蛋白分析(GFP):左图显示Hela细胞转染了减毒Mengo病毒vM16,其中含转染后8小时与病毒L肽链融合的GFP。直方图显示59细胞表达该肽链,并显示不同的表达水平。重叠的红线表示阴性对照。 What can Flow Cytometer tell us about a cell?Cell Lineage/Subset PhenotypeCytokine/ChemokineProduction RepertoireCytokine/ChemokineReceptor RepertoireMigration/Homing PhenotypreCell cycle status细

40、胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特核的特异性抗原异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用直接染色 Fluorescent probe attached to antibody Specific signal: weak No

41、nspecific binding: low间接染色 Fluorescent probe attached to a 2nd antibody Specific signal: strong, 5-6 2nd Ab/each 1st Ab; Nonspecific binding: highAvidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dyePropidium IodideDNAExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nmFluorescein (FITC)500 nmWavelengthProtein300 nm 400 nm 500 nm 600 nmExcitationEmissonPhycoery

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