金色链霉菌原生质体的制备_邱荔

1、第29卷第2期福州大学学报(自然科学版Vol.29No.2 2001年4月Jour nal of Fuzhou U niversity(N atural ScienceApr.2001文章编号:1000-2243(200102-0124-04金色链霉菌原生质体的制备邱荔1,孟春1,郭养浩1,胡诗国1,林冉1,程绍军2(1.福州大学侨兴轻工学院,福建福州350002; 2.江西省医药学校,江西南昌330001摘要:对金色链霉菌原生质体制备的具体条件进行了优化研究.发酵培养基中采用蔗糖浓度12%、甘氨酸浓度0.5%、酶解条件采用菌龄为48h的菌丝、溶菌酶浓度6mg/mL、酶解时间为1h制备原生质体

2、,原生质体制备率可高达60%以上.关键词:金色链霉菌;原生质体;再生中图分类号:Q815文献标识码:A在抗生素工业中,天然抗生素约有60%以上是由链霉菌产生的1.近年来,随着基因克隆技术的逐步完善和对链霉菌基因表达研究的逐步深入,已发现链霉菌基因组分子量大,其原生质体经PEG处理后可以有效地吸收外源DNA2,成为重组DNA技术中表达异源基因的良好宿主,从而在寻找新的天然抗生素产生菌的同时,又开辟了利用重组克隆技术产生新的抗生素的途径.在重组DNA技术的使用过程中,要使外源DNA良好地克隆进宿主原生质体中,制备优质的宿主原生质体和转化子的再生成为关键步骤.由于不同的链霉菌菌株具有各自的特性(如培

3、养基组成不同、菌本身的胞壁结构不同、生长条件不同等,其原生质体制备条件也互不一致.目前未见有对金色链霉菌的原生质体制备条件的报道,所以针对金色链霉菌的菌株特性,研究了影响原生质体制备的一系列因素.1材料和方法1.1菌种和试剂1金色链霉菌为我室保藏菌种.2溶菌酶购自上海生物工程有限公司.3溶菌酶液,P-Buffer,10.3%蔗糖溶液,0.01%SDS溶液配制见操作手册3.1.2培养基1种子培养基组成:葡萄糖、牛肉浸膏、酵母浸出物、酪蛋白水解物.2发酵培养基组成:YEM E培养基3.3再生培养基组成(pH7.0:葡萄糖、蔗糖、牛肉浸膏、酵母浸出物、酪蛋白水解物、琼脂.1.3原生质体制备步骤1从金

4、色链霉菌斜面上刮取适量孢子,接种于种子培养基(500mL三角瓶,每瓶装30m L种子液体培养基,放于旋转式摇床上(250r/min,在3032e的条件下培养.2培养1d后,取出3份等量样品分别装入3个无菌离心管(A,B,C中,离心(6000r/m in,5 min,倒去上清液.3在3管中各加入10.3%蔗糖溶液,混匀后离心(6000r/min,5m in,倒去上清液,然后重复洗涤沉淀一次.4取B,C管的沉淀加入溶菌酶液于3335e培养一段时间后,离心(6000r/min,3min,倒去上清液,用P-Buffer洗涤沉淀1次,将A,B管沉淀悬浮于P-Buffer中混匀,将C管的沉淀悬浮于0.01

5、% SDS溶液中混匀,分别用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤到另一无菌试管中,各取适量涂布于再生培养基上,收稿日期:2000-07-05作者简介:邱荔(1975-,女,硕士研究生;郭养浩为通讯联系人.基金项目:福建省科委基金资助项目(99-H-46于3234e 倒置培养.当平皿长出可见菌落时,即可计数.最终菌落数(个/mL=平皿菌落数(个/m L样品稀释倍数.其中,A 平皿长出的菌落数为酶解前的菌丝数,B 平皿长出的菌落数为再生的原生质体数和残余菌丝数,C 平皿长出的菌落数为残余菌丝数.这是因为原生质体对SDS 非常敏感3,所以用0.01%SDS 悬浮的沉淀涂布后再生的应是滤液中残余的菌丝生成的菌落.

6、由此可算出原生质体形成率:x %=B -CA100%其中:A 为酶解前的菌落数(个/mL ;B 为原生质体数和残余菌丝数(个/mL ;C 为残余菌丝数(个/mL .1.4 实验方法1菌丝量计算:将发酵液离心,沉淀菌丝体积占总体积比为菌丝量(%.2pH 值测定:采用METTLA TOLENT O 320pH 计.3原生质体占有数(个/mL=B -C.2 结果与讨论2.1 YEME 的改进将种子液接入链霉菌适宜生长的YEME 培养基,发现菌体在YEME 中不能继续生长,推断有可能是蔗糖浓度或是甘氨酸浓度过高.以蔗糖浓度、甘氨酸浓度为因素,各选择3个水平作正交实验,菌体生长情况见表1(初始菌体量为0

7、.17%.表1 不同蔗糖、甘氨酸浓度对金色链霉菌生长的影响序号U 蔗糖/%U 甘氨酸/%培养48h 的菌体量/%初始pH 值培养48h 后的pH 值1120.2 3.3 6.208.182120.3 4.6 6.218.563120.5 5.5 6.218.594240.20.33 6.21 4.715240.30.25 6.22 4.886240.50.29 6.21 4.497360.20.18 6.21 4.928360.30.28 6.21 5.049360.50.346.214.68实验结果表明,金色链霉菌可利用蔗糖作为碳源,在蔗糖浓度不高的情况下,菌丝较易聚集成团,降低溶酶效率,但

8、如果蔗糖浓度高过20%,菌体在代谢的过程中产生过多的有机酸,造成pH 值低于5.0,抑制了菌体的生长,所以24%、36%的蔗糖浓度均不适合菌体的继续生长,只有12%的浓度适合.另一方面,甘氨酸在培养基中的作用是代替D-丙氨酸掺入细胞壁,破坏细胞壁肽聚糖短肽间的交联,引起细胞壁结构的不完整以便于酶解破壁4.考虑到酶解时间和甘氨酸浓度对溶酶效率的交互影响,逐选择3种酶液浓度0.2%、0.5%、1%,2种酶解时间分别为1、2h,进行了原生质体制备实验,结果见表2(初始菌体量为0.17%,初始pH 值6.21.实验结果表明,甘氨酸的浓度高于0.5%时,菌体量少于3.1%,原生质体占有数也低于4000个

9、/mL.这可能是因为甘氨酸浓度过高,抑制了菌丝体的生长4.另外,从酶解效果来看,甘氨酸浓度为0.2%时,原生质体占有数随酶解时间增加而增加,酶解2h 时,原生质体占有数达到1.5105个/mL.甘氨酸浓度为0.5%时,随着酶解时间增加,原生质体占有数先增加后减少.酶解1h,原生质体占有数达到2.03105个/mL,酶解2h,原生质体占有数下降至0.99105个/mL.这可能是因为在不影响菌丝生长的情况下,甘氨酸浓度越高,细胞壁结构越便于酶解,所以0.5%的浓度酶解1h 所获得的原生质体数大于0.2%的浓度酶解2h 的,而且酶解得较完全.若再增加酶解时间,则形成的原生质体会受到酶的破坏,造成原生

10、质体数目下降.所以经过比较,在发酵培养基中采用蔗糖浓度12%,甘氨酸浓度0.5%为较优方案.#125#第2期邱荔等:金色链霉菌原生质体的制备表2 不同甘氨酸浓度、酶解时间对原生质体制备的影响序号U 甘氨酸/%t 酶解/h 培养48h 的pH 值培养48h 菌体量/%原生质体占有数/个#mL -110.218.18 3.20.13610520.228.21 3.4 1.510530.518.59 5.3 2.0310540.528.60 5.50.991055117.90 2.932506128.053.021002.2 菌龄、溶菌酶浓度的确定处于不同生长时间的菌体,经过处理后都可以形成原生质体

11、,但其活性差异很大.处于稳定期和衰老期的菌体,由于菌体老化生理活性低,此时期制备的原生质体大小差异很大,异质性明显,再生能力差;而对数期(包括对数前、中、后期的菌丝各部分生理差异小,菌丝活力高,所制备的原生质体内含物及细胞器缺损少,修复能力高,再生效果好4.所以根据金色链霉菌发酵特性,选择24h 和48h 的菌丝来进行原生质体制备实验.另一方面,溶菌酶浓度对原生质体的制备也是一个重要因数,酶量过低,影响原生质体化,酶量过高,不仅会影响原生质体活性,而且影响原生质体再生率.本实验考虑到酶浓度,酶解时间,菌龄三者对原生质体制备的交互影响,选择酶浓度3、6mg/mL,菌龄24、48h,酶解时间1、1

12、.5h,进行了正交实验,结果见表3.表3 不同酶浓度、酶解时间、菌龄对原生质体制备的影响序号Q 酶/mg #mL -1t 菌龄/h t 酶解/h 原生质体占有数/个#mL -1原生质体形成率/%132410.225105232324 1.50.26910527.533481 1.588105534348 1.5 1.64810555562410.297105306624 1.50.23610523.876481 1.9981056686481.51.58910552. 5图1 不同酶浓、酶解时间、菌龄对原生质体制备的影响实验结果表明,在酶解时间和酶浓度相同的条件下,菌龄48h 的比菌龄24h

13、的便于酶解(图1.这可能是因为24h 的菌丝尚处于生长期,制备出来的原生质体再生能力差,即使增加酶浓度原生质体占有数也只能达到0.297105个/mL,形成率为30%.而对于同样菌龄的菌丝,酶浓度为3mg/mL 时,酶解时间越长,效果越好,但酶浓度为6mg /mL 时,酶解时间的增长,反而使原生质体数目下降,这可能是因为高的酶浓度情况下,1h 就已经基本酶解完全,若再增加酶解时间,酶会对生成的原生质体发生作用使细胞质膜受到损伤,造成大量的原生质体破坏,从而使其失活,原生质体形成率下降.所以溶菌酶处理较佳条件是菌龄48h,酶浓度6m g/mL,酶解时间1h,在此条件下原生质体占有数1.99810

14、5个/mL,原生质体形成率达到66%.3 结语1金色链霉菌原生质体制备发酵培养基配方中,蔗糖较优含量为12%,甘氨酸浓度为0.5%时,即改善了菌丝易聚集成团的特性,又使酶解效率提高.2金色链霉菌原生质体制备较优条件为菌龄48h,溶菌酶浓度为6mg/mL,酶解时间1h.此实验条件下,原生质体制备率可达到66%.#126#福州大学学报(自然科学版第29卷参考文献:1 Iain S Hunter.链霉菌的基因克隆化J.国外医药抗生素分册,1988,9(4:241-251.2 邓子新.链霉菌基因表达分子的新进展J.中国抗生素杂志,1990,15(3:231-235.3 霍普伍德.链霉菌遗传操作实验手册

15、M .邓子新译.长沙:湖南科学技术出版社,1988.4 贺筱蓉,黄小倩.链霉菌原生质体的制备J.生物学通报,1998,33(1:40-41.Production and regeneration of protoplast of streptomyces aureofaciensQIU Li 1,M ENG Chun 1,GUO Yang -hao 1,HU Shi-g uo 1,LING Ran 1,CH ENG Shao-jun 2(1.College o f Q iao xin Lig ht Industry,F uzhou U niversity ,Fuzhou,Fujian 3500

16、02,China; 2.Pharmaceutic School of Jiang xi Province,Nanchang ,Jiangx i 330001,ChinaAbstract :T he conditions of producing and reg enerating protoplast of streptomyces aureofaciens were opt-im ized.In culture medium,the better concentration of sugar and glycine w ere 12%and 0.5%respectively.T he opt

17、imum conditions of protoplast production of streptom yces aureofaciens were w hen cells w ere cultured to 48h and concentrations of lysine enzyme w as added to 6mg/mL and lysine time reached 1h.The producing rate of protoplast was over 60%under the conditions.Keywords:streptomyces aureofaciens;proto

18、plast;regeneration(接第97页4 杨锋,颜肖慈,欧阳礼,等.拓扑指数F(c F与气相色谱保留指数RI 的相关性研究J.分析化学,1998,26(5:497500.5 杨家安,江元生.饱和链烃图特征和热力学性质J.化学学报,1983,41(10:884894.6 朱昌中,朱鑫璋,吴锦屏,等.一种新的分子拓扑指数J.化学通报,1995,1:1518.7 Randic M.On characterization of molecular branchingJ.J Amer Chem Soc,1975,97(25:66096615.8 冯长君.T s ,m k X及其应用J.吉林大学

19、学报(自然科学版,1999,4:71.9 成都科技大学分析化学教研室.分析化学手册(第四分册M .北京:化学工业出版社,1984.10 任碧也,许友,陈国斌.一个新的拓扑指数用于有机化合物QSPR/QSAR 研究J.化学学报,1999,57(6:569571.Stu dy on the quantitative structure -retention relationship of alkanes,alcohols and ethersDU Xi-hua,FENG Chang -jun(Depar tment of Chemistry,Xuzhou Education Co llege,Xuzhou,Jiangsu 221006,ChinaAbstract:Based on the adj