纯二氧化碳气体对卵巢癌细胞生长及运动能力的影响

1、纯二氧化碳气体对卵巢癌细胞生长及运动能力的影响         08-07-31 14:42:00     作者：张爱荣，张萍，孔北华    编辑：studa20【摘要】  目的：观察纯CO2气体环境对卵巢癌细胞SKOV3生长及运动能力的影响。方法：将体外培养的卵巢癌SKOV3细胞悬液接种于96孔板，将培养板分别暴露于纯CO2环境1、2、3h，对照组放入常规细胞培养箱培养。纯CO2处理后24、48、72、96、120h，用四唑

2、盐(MTT法)比色试验测定各组细胞的比色值，观察细胞生长情况，绘制细胞生长曲线，观察各组细胞倍增时间。采用划痕(Woundassay)试验测定各组细胞随机运动能力的变化。结果：卵巢癌细胞SKOV3暴露于纯CO2环境后第24、48、72小时 MTT值与对照组无显著性差异，第96小时后其MTT值明显高于对照组，其差异程度与暴露于纯CO2环境时间呈正相关。实验组细胞倍增时间较对照组缩短。各组细胞随机运动能力无显著性差异。结论：纯CO2气体环境对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响与作用时间有关，卵巢癌细胞暴露于纯CO2环境短时间（12h）内，对细胞生长无明显影响，3h后对肿瘤细胞的生长有明显促进作用。纯C

3、O2环境对肿瘤细胞的随机运动能力无明显影响。 【关键词】  二氧化碳；肿瘤细胞；细胞培养；细胞生长；细胞运动Effect of carbon dioxide on growth and movement of human ovarian carcinoma cell in vitro 【Abstract】  bjective:To observe the effects of carbon dioxide on growth and movement of human ovarian cancer cells in vitro Such study will provide

4、 a primary evidence for the safety of CO2 pneumoperitoneum laparoscopy surgery in malignanciesMethods:Immortalized ovarian epithelial carcinoma cell (SKOV3 cell line) cultures were exposed to carbon dioxideCell growth was determined by spectrophotometric assay(MTT)Cell movement was determined with t

5、he use of WoundassayThe results were compared with control cells by paired test and liner regressions analysis.Results：The levels of MTT of carcinoma cells that were exposed to carbon dioxide had increased after 4 days in cultureThe increased cell growth had a linear relationship to the length of ca

6、rbon dioxide exposure.The doubling time of carcinoma cells exposed to carbon dioxide was shorter than that in control cells.The number of migrating cells (SKOV3)into the wound surface were no significant difference to be found among four groups (P>005)Conclusions：Carbon dioxide exposure increases

7、 the growth of human ovarian carcinoma cells in vitroThere is no effect on movement of SKOV3 cell after exposed to carbon dioxide【Key words】  Carbon dioxide;Ovarian cancer cell;Cell cultures;Cell growth;Cell movement近10余年来，腹腔镜手术以其创伤小、痛苦少、恢复快等优点深受患者欢迎，国内外已广泛应用腹腔镜处理妇科良性疾病。随着腹腔镜技术和设备的不断发展，其适应证逐渐拓宽

8、至恶性肿瘤治疗领域，但腹腔镜肿瘤外科手术引起的切口种植率要高于开腹手术,致使腹腔镜手术在恶性肿瘤领域的应用存在争议，其焦点在于腹腔镜手术中所使用的人工气腹介质CO2是否促进腹腔恶性肿瘤细胞的生长。CO2气体作为人工气腹介质可以被腹膜迅速吸收、不助燃、安全而在临床上得到广泛应用。本实验旨在研究模拟CO2气腹条件下，对体外培养的卵巢癌细胞SKOV3生长增殖及运动能力是否有影响。  资料与方法  临床资料  选取人卵巢癌细胞SKOV3(山东大学齐鲁医院肿瘤中心馈赠)，体外培养于RPMI1640完全培养液(含体积分数为10%小牛血清、10万U/L青霉素及10万U/L链霉素

9、)中。传23代后，制成细胞悬液，以台盼蓝染色后在荧光显微镜下计数，活细胞比例>95%，调整浓度为1×105/ml的细胞悬液。2  方法  将细胞悬液分别注入A、B、C、D 4个96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数1×104，每板共接种42孔。D板为对照组，放入CO2培养箱(内含5%CO2，95%的空气，37)中培养。将A、B、C板分别放入无菌密闭塑料袋内，用CO2自动气腹机充入100%CO2气体，充气压力为10mm Hg，于细胞培养箱中维持模拟气腹状态，A板持续时间为60min，B板为120min，C板为180min。充气结束后，将A、B、C板由密闭

10、塑料袋中取出，脱离纯CO2环境，放入CO2培养箱中继续培养。于CO2处理后24、48、72、96h，分别进行四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应2，用分光光度计在波长492nm处测定OD值。并采用细胞计数绘制各组细胞生长曲线，计算细胞倍增时间，同时检测各培养液的PH值。划痕法细胞运动性测定：采用改良的Birth等3创建的划痕法（Woundassay）检测细胞随机运动能力。取24孔培养板，先将纤维粘连蛋白（FN）用灭菌PBS缓冲液稀释成浓度10mg/ml，每孔加300l，室温放置1h后用PBS缓冲液清洗2次。于暴露纯CO2后24h，各组取10孔制备细胞悬液，按1×105/孔接种于24孔培

11、养板，每种细胞重复3个孔，于37 5%CO2培养箱常规培养至细胞融合度达60%80%时，用细胞刮刀在孔内侧单层细胞表面划出一条宽度为4mm的横行无细胞刮除带，用PBS缓冲液漂洗2次，以去除划下的细胞，加入新鲜培养液继续培养，每3h于倒置相差显微镜下利用方格测微尺测定细胞向空白区的位移情况。为避免细胞倍增对实验的影响，试验在18h后终止，计数迁移到单位长度划痕区的细胞数。于暴露纯CO2后72、96h重复上述步骤。3  统计学分析  采用方差分析q检验。2  结果21  CO2处理后各时间MTT值见表1  暴露纯CO2不同时间后24、48、72h各组间MTT值无显著性差异，96h后A、B、C 3组MTT值较D（对照）组明显增高，差异有显著性（P<005），并且与暴露于纯CO2的时间呈正相关。  表  CO处理后各时值（略）*P<005 vs.A、B、D组22  各组细胞倍增时间见表2  暴露于纯CO2环境不同时间后，肿瘤细胞的倍增时间均