硕士论文――过渡元素与血红蛋白的作用及其结构研究_图文

1、目录中文摘要 (iAbstract (ii第一章综述前言 (1第一节蛋白质同金属离子的相互作用研究进展 (11.1. 过渡元素与蛋白质的相互作用 (31.2. 稀土离子同蛋白质的相互作用 (31.3. 贵金属同蛋白质的相互作用 (41.4. 重金属与蛋白质的相互作用 (51.5. 其它情况 (5第二节稳定常数测定 (6第三节蛋白质的结构研究 (73.1 红外光谱 (83.2 核磁共振 (103.3 拉曼光谱 (113.4 X-ray衍射 (113.5 电子晶体学 (12参考文献 (13第二章过渡金属与血红蛋白的相互作用第一节实验部分 (191.1 仪器、试剂及实验条件 (191.2 实验方法

2、(19第二节结果与讨论 (212.1 温度的影响 (212.2 反应时间的影响 (212.3 平衡常数测定 (222.4 红外光谱结构测定 (24参考文献 (28第三章贵金属与血红蛋白的相互作用第一节实验部分 (301.1 仪器、试剂及实验条件 (301.2 实验方法 (30第二节结果与讨论 (312.1 电子能谱研究 (312.2 红外光谱解析 (33第三节结论 (38参考文献 (39第四章贵金属同过渡元素与血红蛋白作用的红外光谱研究第一节实验部分 (411.1 仪器、试剂及实验条件 (411.2 实验方法 (41第二节结果与讨论 (422.1 血红蛋白的红外谱解析 (422.2 AuCu-

3、Hb络合物的红外光谱解析 (422.3 PtNi-Hb络合物的红外光谱解析 (442.4 IrCo-Hb络合物的红外光谱解析 (46第三节结论 (49参考文献 (50附录已发或待发文章致谢摘要本文主要研究了牛血红蛋白(Hb与多种金属离子相互作用的平衡常数及所生成络合物的结构。用ICP-AES测定,根据Langmuir方程:n i/(n s-n i=KC,作图计算了Cu2+与Hb结合的平衡常数(K及Zn2+、Ni2+存在下对Cu2+与Hb结合平衡的影响,并用FTIR光谱对Hb及其金属络合物的结构进行了对比研究。结果表明,Zn2+对K的影响较大,使K值从3.461103 l/mol变为2.1981

4、03 l/mol, Ni2+的作用不很明显,Ni2+存在时的K值为3.208103 l/mol,且Zn2+的结合使Hb的构象发生了很大变化。另外,采用电子能谱技术研究了单核贵金属血红蛋白络合物中配位原子键合能的变化,并运用去卷积曲线拟合FTIR技术对固态Hb及其贵金属络合物红外酰胺I带(1700-1600 cm-1中二级结构的各个成分进行了定量分析,对酰胺II带(1600-1500 cm-1中二级结构的各个成分进行了初步指认。结果表明,Hb中的-helix(1646.31cm-1含量为71.0%,不含-sheet结构,其它组分含量为29.0%,其中主要是转角结构(1691.43cm-1,这与X

5、-ray分析结果及FTIR测定水溶液、重水溶液或CDCl3溶液中的Hb 得到的结果相一致。贵金属与Hb的作用对Hb结构的影响基本一致,均使-helix含量减少,尤其是Au3+和Pt4+的作用更为相似,Ir4+同Hb的作用使Hb中-helix 减少的同时增加了其中的-sheet成分,且Co2+与Ir4+之间存在一定程度的协同作用,两种离子共存时促进了Hb的结构从-helix到-sheet的转变;而Au3+与Cu2+之间存在拮抗作用,Cu2+的存在对Au3+与Hb的结合有抑制作用;Pt4+的存在并没有使Ni2+与血红蛋白的作用增强,Ni2+的存在对Pt4+与血红蛋白的作用也影响不大。Abstrac

6、tIn this article, the interaction of metal ions with bovine hemoglobin (Hb were investigated, the equilibrium constant K of Cu2+ with bovine hemoglobin and the influence of Zn2+ and Ni2+ to the binding process of Cu2+ with Hb were determined. The conformational changes of Hb and its metal complexes

7、were discussed by using FTIR. It was found that the influence of Zn2+ to K is large, K is changed from 3.461103 l/mol to 2.198103 l/mol,but the influence of Ni2+ to K is little, K is changed to 3.208103 l/mol ,and the structure change is very large in the existence of Zn2+ .The ligand binding energy

8、 changes of the complexes of AuHb、PtHb、IrHb were investigated by using X-ray photoelectron spectrometry(XPS. In addition, the quantitative secondary structure conformational analysis of Hb and all noble metal complexes in solid state, based on fourier transform- infrared(FTIR self-deconvolution and

9、curve-fitting procedures of the amide I band region(1700-1600 cm-1 was investigated, the result is 71.0% -helix (1646.31cm-1and no -structure in Hb, which are in accordance with the results of X-ray and FTIR in aqueous、D2O or CDCl3resolution. And the qualitative secondary structure conformational an

10、alysis of amide II band region (1600-1500 cm-1was also investigated. The interaction of noble metal ions with hemoglobin is similar, particularly for Au3+ and Pt4+, major conformational changes is the decrease of -helix. For CoHb、IrHb、IrCo-Hb complex, major conformational changes are from -helix to-

11、sheet, and the interaction of Co2+ and Ir4+ with Hb is coordinative , but for Au3+ and Cu2+ is in-coordinative, and there is no coordination of Pt4+ and Ni2+ with Hb.第一章综述前言众所周知,蛋白质是生命机体所必不可少的生命基础物质,是生命机体进行各种生理活动的主要承担着。蛋白质种类繁多,目前已经发现的蛋白质数量已达几百万种,但是各种蛋白质均是含有多个配位原子(如:N、O、S,有些蛋白质还含有P等的大分子多齿配体,因此能够很容易地与

12、金属离子或其小分子配合物相互作用。蛋白质的功能与其结构构象密切相关,有什么样的结构就有什么样的功能,反之亦然。蛋白质某种生物功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关;同时,蛋白质某种生物功能或活性的减弱或消失也往往是受某种沾染元素或有害元素的影响,这些元素大多数是金属元素,它们通过与相关蛋白质的作用来稳定或改变蛋白质的结构构象,从而达到控制或影响蛋白质功能的目的。因此可以说,研究金属元素同蛋白质的相互作用特别是多种不同金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质结构构象的变化,阐明某种金属元素的作用机理,从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响、预防中毒

13、及环境污染治理等有重要意义。蛋白质与金属离子相互作用的研究早在50年代就已开始进行。自60年代以来,采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋白和金属酶的结构,配合生物活性研究推测了它们的作用机理,这些研究构成了生物无机化学的主要研究方面。80年代以来,各种检测技术及计算机技术的发展为人们研究蛋白质同金属离子的相互作用打开了一个新的局面,这方面我国的生物无机化学家王夔1、申泮文2-4等已作了大量的研究工作,并有多部相关专著。第一节蛋白质同金属离子的相互作用研究进展蛋白质自身结构及配位环境的复杂性决定了蛋白质同金属离子相互作用的复杂性。蛋白质可以与金属离子直接作用形成络合物,也可以与金属小分

14、子配合物发生配体交换反应或加合反应,若是含金属的蛋白质,也可发生金属离子之间的置换反应,这在重金属中毒方面尤为常见。金属离子常充当蛋白质构象变化的诱发因子,而且同种金属离子或不同金属离子之间常存在不同程度的协同拮抗作用,且对不同的蛋白质这种作用的方式和程度是不同的。对同种金属离子来说,一个离子的结合引起蛋白质构象发生变化,使蛋白质的紧密结构趋于松散状态,可能裸露出更多的结合部位而引发更多金属离子的结合,从而引起整个蛋白分子构象的变化。最突出的例子是钙触发蛋白,它的触发活性表现在细胞内钙离子浓度的变化迅速影响蛋白质的构象和组装,这一全过程包括钙离子结合在两螺旋结构之间有一定柔性的结构部分上引起运

15、动,这种运动规模较大,而且可以通过蛋白链传递下去,引起整个分子构象的巨大变化。蛋白质分子中不同配位原子或不同位置的相同配位原子的配位能力也是不同的,它们的空间位置是否与金属离子的配位构型相一致,以及它们在大分子中所占位置是否对向其进攻的金属离子开放等条件都决定了金属离子只能在一定位置的几个功能基团上形成稳定结合。金属离子同蛋白质的相互作用除受蛋白质本身刚性和柔性结构影响外,还受金属离子电荷、半径、配位构型等因素影响,如Zn常与Cys、His以配位键形成四面体结构。另外,反应温度、反应时间、离子浓度(强度、酸度、缓冲液等均影响蛋白质与金属离子的相互作用。特别值得注意的是离子浓度对反应的影响,浓度

16、过高或过低都不会达到理想的实验目的,因为无论是对人体有益的还是有害的元素,它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围,任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响,而且蛋白质本身还存在盐析作用,因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围。由于蛋白质种类繁多,且某些蛋白质的提取、分离、纯化十分困难,价格昂贵,因此目前研究的较多的是一些常见的蛋白质,如:血红蛋白、血清白蛋白、肌红蛋白、伴清蛋白等及一些金属蛋白(钙调蛋白、铜蛋白等,以及一些植物蛋白,如:天花粉蛋白等。对一些常见的生命元素及稀土元素研究较多,对贵金属元素主要侧重于有抗癌活性的顺铂类小分子配合物与蛋白质相互作用的机理研究上;对重金属而

17、言,重金属元素同蛋白质、特别是同血液中蛋白质的相互作用及同正常生命元素与蛋白质的竞争结合、置换作用等的研究已有不少文献报道5-8。1.1. 过渡元素与金属离子的相互作用人们对过渡元素同金属离子的作用研究较多,其中研究得最多的是Cu、Zn、Ni、Mn 等,蛋白质中研究得最多的是血清白蛋白(HSA和BSA、肌红蛋白(Mb和血红蛋白(Hb,一些过渡金属离子与蛋白质的作用见下表(表一。表一. 过渡元素与金属离子的相互作用元素蛋白质研究方法参考文献Cu 家蚕丝蛋白、BSA、HSA、Hb紫外可见光谱、ESR、X-ray、紫外、荧光9-12Zn BSA、HSA氨酰传递RNA合成酶紫外、荧光、EXAFS荧光、

18、平衡透析13-16Ni BSA、HSA、Hb 荧光17-19Co BSA、HSA、Hb、Mb金属硫蛋白紫外可见光谱NMR 、X-ray20-25Mn BSA、HSA、Hb叶绿体光获蛋白平衡透析FTIR26-27Cd BSA、HSAPSII蛋白质平衡透析FTIR28-29V Hb 荧光301.2. 稀土离子同蛋白质的相互作用稀土离子因与钙离子性质及半径相似,且电荷高,离子势大,对以离子键为主的化合物来说,结合稳定性高于钙,它能够占据或取代钙的位置而影响一系列的生物功能;此外,稀土离子因具有4f电子而能产生一系列的光磁效应,是蛋白质化学研究中的主要探针;而钙离子是一种重要的生命元素,对于维持细胞正

19、常功能、肌肉收缩、信息传递、神经冲动传导及骨骼的形成等起着十分重要的作用,因此研究稀土离子同蛋白质的作用尤其是同含钙蛋白质的作用十分重要,这方面已有很多的研究报道(见表二。表二. 稀土离子与蛋白质的相互作用蛋白质研究方法参考文献钙调蛋白红外光谱(IR31-35肌动蛋白CD、UV差光谱36-38铁传递蛋白穆斯堡尔谱39-40免疫球蛋白质子驰豫加强、EPR 41-42伴刀豆球蛋白A 核磁驰豫研究、荧光43-44肌红蛋白Raman光谱45HSA、BSA UV、IR、CD、NMR、荧光46-48血红蛋白Hb NMR、荧光49-50-球蛋白质子驰豫加强51牛血Cu(Zn-SOD ESR、CD、荧光521

20、.3. 贵金属同蛋白质的相互作用(表三表三. 贵金属与蛋白质的相互作用贵金属蛋白质研究方法参考文献六氯合铂酸钾金属硫蛋白紫外、电子能谱、CD 53顺二氨二水合铂膜蛋白、膜膦脂荧光54顺二氯二氨合铂红细胞膜蛋白ESR 55顺铂、反铂红细胞膜糖蛋白荧光、电泳、CD 56顺铂F-肌动蛋白LMCT谱57Ag-Cu 血红蛋白IR、Raman 58-59Fe-Ru 血红蛋白NMR 60-621.4. 重金属与蛋白质的相互作用在重金属与蛋白质的相互作用研究中,研究得最多的是Hg、Pb与各种蛋白质特别是血液中的蛋白质的相互作用63-67,这种相互作用往往是金属离子同蛋白质的络合或取代其中的有益元素。除金属离子

21、本身外,一些阴离子配合物,如:HgCl42-、HgBr42-、HgI42-或Hg(SCN42-也与蛋白质结合,这可能是由于配合物的离解,如HgI42-离解产生HgI3-、HgI2和I-,反应可能通过一非电荷体系进行,或者这些阴离子基团与蛋白质上的特定部位发生静电相互作用或范德华力作用等。Steinberg 和Sperling68还指出汞原子可能插入胱氨酸的二硫键Hg22+RSSR=2(RSHg+=RSHgSR+Hg2+,通过破坏二硫键来改变蛋白质的结构。Nahar S28等人研究了二价Cd、Hg、Pb与PSII富集膜蛋白的相互作用,用去卷积二阶导数FTIR差异光谱研究了金属蛋白质相互作用的本质

22、及形成金属络合物后蛋白质的构型转变和结构变化。结果表明,低离子浓度时无金属离子与蛋白质的主要相互作用;高浓度时,观察到金属离子结合在蛋白质中酪氨酸残基的C=O和C-N基团上,同时还可观察到汞与硫的结合,主要构型转变是从未配位蛋白质的64%的螺旋和10%的折叠到络合物的55-40%的螺旋和10-20%的折叠。1.5. 其它情况一些主族元素如Ca、Mg、Na、K、Al等与蛋白质相互作用研究的报道也很多69-72。此外,血红蛋白是一种价格便宜、制备简单的重要蛋白质,在体内血浆中担负着吸氧输氧功能。Perutz等对血红蛋白的结构构象研究很深,弄清楚了血红蛋白吸氧脱氧的机理及其对血红蛋白结构的影响,以及

23、血红蛋白的Bohr效应等。对血红蛋白双核金属杂化物的研究近年来已有不少报道(见表四,主要是各种不同的过渡元素取代Hb亚单元中的部分Fe从而生成双核Hb杂化物,并采用X-ray、NMR、EPR等手段进行了结构测定及杂化物吸氧平衡研究。表四. 血红蛋白双核杂化物的研究金属元素研究方法参考文献Ni-Fe X-ray 73-74Mn-Fe FTIR 75-76Mg-Fe X-ray 69,77Co-Fe X-ray、EPR、Raman 78-79Zn-Fe X-ray 80-81Cu-Fe EPR 82Ru-Fe NMR 60Co-Zn EPR 21第二节稳定常数测定在金属离子与蛋白质的相互作用研究中

24、,金属离子在蛋白质上的结合量、结合部位及反应稳定常数的研究也是十分重要的。对结合量的测定常采用光度法、ICP、AAS等手段来进行;结合部位的测定可采用氨基酸残基修饰法、离子探针法及紫外、拉曼光谱等手段检测某些有特定波长吸收峰的氨基酸残基的波长变化等,还可通过稳定常数对介质pH值的依赖关系来判断,如金属结合蛋白的稳定常数在pH5.6-7.0范围内突然变化,就表明金属结合的部位有组氨酸残基。对结合量的测定,特别是不同离子浓度结合蛋白质后结合量的测定是研究稳定常数的基础,对金属结合蛋白质的稳定常数测定同普通的金属离子配体体系基本相同。这方面申泮文等人做了大量工作2-4,采用平衡透析法对Cu、Zn、N

25、i同HSA、BSA相互作用的稳定常数及共存离子对稳定常数的影响进行了深入研究,结合Adair 方程、Scatchard作图法及非线性最小二乘法拟合Bjerrum函数等方法处理数据,同时用Hill系数来定量分析了Ni同HSA、BSA中多个结合部位之间的协同性,发现Hill系数同样是”S”形曲线,对两体系Ni(II- HSA和第三节蛋白质的结构研究对蛋白质结构的研究一直是蛋白质研究领域人们所关注的焦点,但直到1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang第一次提出蛋白质三级结构的概念,才使蛋白质的结构研究走上了正确的道路,随后英国晶体学家Bernal 于1958年提出了蛋白质的四级结构。

26、近年来,随着蛋白质结构研究技术的发展,蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构层次,即超二级结构和结构域,超二级结构是由Rossmann于1973年提出的,是指两个或多个二级结构单元进一步组合成的有特殊几何排列的局域空间结构,结构域是由免疫化学家Porter提出的,是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。近年来,随着生物技术及各种分析测试技术的进步,对蛋白质结构的研究也有了很大发展。如血红蛋白的四级结构含1、1、2、2四个亚单元(图1。 在蛋白质结构的研究中,红外、紫外、拉曼、荧光、圆二色性、X-射线晶体衍射、核磁共振和电子晶体学等均有广泛应用,另外诸如穆斯堡尔谱39、旋光色散(

27、ORD、磁圆二色性(MCD、电子顺磁共振(EPR、磁化率等手段在蛋白质的结构研究方面亦有报导83-86。由于蛋白质中含有芳香族氨基酸侧链,主要是酪氨酸(Tyr、色氨酸(Trp,其次是苯丙氨酸(Phe,它们在280nm附近产生吸收,因此可利用紫外-可见光谱研究蛋白质的结构。蛋白质由于具有不对称碳而具有光学活性,通过对蛋白质园二色谱的测定和计算可了解蛋白质在溶液状态下的二级结构,从而可检测一些反应引起的构象变化。而荧光分析法主要是运用荧光探针技术对蛋白质的疏水区、氨基状态、二硫键等进行检测,也可测定蛋白质的二级结构变化及其变构效应。下面就几种主要的研究方法及其进展加以介绍。3.1红外光谱红外光谱是

28、研究蛋白质二级结构的主要手段之一87-100,它既可以对蛋白质的二级结构进行定性分析,也可以进行定量分析。1950年Elliott 和Ambrose根据模型多肽提出的红外酰胺I带16601650cm-1的峰属螺旋结构、16401630 cm-1的峰属折叠构象的假设是定性估计蛋白质二级结构的基础87-88。70年代中期发展了若干半定量计算蛋白质构象的方法,这些方法的局限性在于要求很多参数,而实际工作的难度恰在于此。1983年Susi和Byler首先将二阶导数理论应用于研究二级结构,1986年他们又将卷积方法应用于二级结构分析89,使得红外分析蛋白质二级结构进入定量化阶段。蛋白质在红外区域表现为9

29、个特征振动模式或基团频率(见表五 90-91,其中最常用于二级结构分析的是位于17001600cm-1范围的酰胺I 带。由于蛋白质含有多种不同的二级结构单元,这些构象对应的振动吸收峰重叠在一起形成宽峰,各子峰固有的宽度大于仪器分辨率,利用普通光谱技术难以将各子峰分开,而傅里叶变换红外的高分辨率、高灵敏度、高信噪比及准确的频率精度等特点,使得二阶导数、去卷积技术可以应用于FTIR上,因而可把原来酰胺I带中未能分辨的峰分开,并指出各子峰的峰位值,然后通过曲线拟合,定量分析蛋白质二级结构的各个组分。表五. 酰胺基团的特征振动名称波数/cm-1振动模式酰胺A 酰胺B 酰胺I 酰胺II 酰胺III 酰胺

30、IV 酰胺V 酰胺VI 33003100166015701300630730600N-H伸缩振动酰胺II带的一次泛频,费米共振C=O伸缩振动N-H面内弯曲振动和C-N伸缩振动C-N伸缩振动和N-H面内弯曲振动O=C-N面内弯曲振动N-H面外弯曲振动C=O面外弯曲振动1986年Byler和Susi用二阶导数和去卷积方法对19个蛋白质中的38个子峰进行了系统的分析89,给出了红外光谱中各构象成份特征酰胺I 带位置与二级结构的关系,并基本确定了各子峰的归属,他们还利用去卷积曲线拟合法得到了若干蛋白质二级结构的含量,并与X射线衍射法的结果作了对比,二者十分吻合。随着这一方法的发展和完善,人们对蛋白质二

31、级结构的研究作了大量工作。1987年Alevarez等测定了伴刀豆球蛋白A 结合金属离子Mn2+、Ca2+和-甲基甘露糖等配基前后FTIR光谱的变化。1989年Villalain等92利用高分辨率的FTIR光谱研究了Ca2+及ATP和PO43-等配基结合对Ca-ATPase二级结构的影响。近年来,很多研究者在FTIR测定蛋白质二级结构上作了进一步的探讨。Francoise Dousseau等人利用最小平方法对已知晶体结构的13种蛋白质的水溶液结构的红外酰胺I和II带进行了指认,并提出了计算方法93。Lee等人提出了红外光谱测定二级结构的因子分析法,对已知晶体结构的18种蛋白质的结构进行了测定,

32、这种方法操作简便,不必进行曲线拟合,且部分酰胺I带峰不必进行认定。Remsen还提出了排阻色谱-红外联用技术,利用流动池、以FTIR作为检测器,既可作为大分子的分离手段,又可用于动力学过程的测定,使得对蛋白质折叠过程的研究成为可能。最近Cai等人对1350-1200 cm-1范围的酰胺III带峰进行了归属,认为1330-1295 cm-1范围的峰属于螺旋,1295-1270 cm-1范围的峰属于转角结构, 1270-1250 cm-1范围的峰属于无序结构,1250-1200 cm-1范围的峰属于折叠97。3.2核磁共振NMR技术主要用于水溶液中蛋白质的三级结构测定,已成为水溶液中蛋白质三维结构

33、测定的唯一有效手段101-110。核磁共振技术测定蛋白质的结构始于1957年,用的是40MHZ的谱仪,测定了蛋白质和多肽的氨基酸组成。近年来,随着核磁技术的巨大进步,采用多脉冲,进行多重磁化迁移,检测多种量子相干的二维、三维甚至四维实验方法大量涌现,特别是随着生物工程技术的发展,15N和13C同位素标记蛋白质的制备成为可能,利用15N和13C等核种的杂核三维和四维等新颖NMR技术能够克服信号重叠、简并和线形变宽等障碍;另外,分子力学计算、分子动力学模拟和三维分子模型与显示的计算机技术的发展等大大扩展了NMR在蛋白质的三维结构和分子间相互作用研究方面的潜力。至今,2D和3D-NMR方法已提供了相

34、当数量的小蛋白质的三维完整结构。NMR也能提供非常有价值的有关局部结构、构象动力学方面的信息,还可用来表征电荷状态、构象、与配体结合的解离速度及研究蛋白质卷曲与折叠。此外,NMR技术还可用于鉴定蛋白质分子中某些原子与配体分子中某些原子间的相互接触,研究大分子之间以及它们与小分子之间的相互作用和分子识别。3.3拉曼光谱用激光拉曼光谱可以在生理环境或活体中做实验,使人们能够观察到在自然状态下的生物大分子的特点并探讨它们在经过物理和化学方法处理后构象和构型的变化。对蛋白质来说111-120,拉曼光谱不仅能得到它的氨基酸组成信息,还能得到某些二级结构如螺旋、折叠、无规卷曲及回折方面的信息;不仅能得知它

35、的主链构象特别是酰胺I、III、C-C、C-N 伸张振动,还能得知它的侧链构象,如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的侧链和后两者的构象及存在形式随其微环境而变的情况,同时可以研究对构象变化十分敏感的电离化的羧基、巯基、S-S、C-S键构象的变化,对残基内氢键的变化也能提供不少信息。当蛋白质与金属离子作用时,从它们的拉曼光谱就可得知发生变化的基团、相互作用的地点与模式,从而能够从分子水平较深入地研究它们构象或构型的变化及它们相互作用的机理。由于拉曼光谱在蛋白质酰胺I带水峰很小,因而较红外光谱更为方便测定。Garfinkel和Edsal最早于1958年就开始采用拉曼光谱研究蛋白质Lysozyme113。1

36、987年Berjot114用富含螺旋和折叠的蛋白质计算参考光谱,提出了定量测定蛋白质二级结构的简便方法。这种方法计算的二级结构各成分含量准确性较高,尤其对无序结构的计算准确性有很大提高。近几年来,随着二阶导数和去卷积等方法的应用,拉曼光谱又有了新的发展,若能将FT-拉曼与FTIR结合,将会得到有关蛋白质的大量更为可靠的信息。3.4 X-ray衍射蛋白质的三维结构主要靠X射线晶体学获得121-125。蛋白质晶体的第一个X射线图像是由Bernal和Crowfoot于1934年测定出来的,但当时没有解决蛋白质大分子晶体衍射的相位问题。直到1954年Perutz等人证明重原子同晶置换可以解决相位问题,

37、后又经Blow和Crick加以发展,才解出了蛋白质的晶体结构。第一个测定出晶体结构的蛋白质是肌红蛋白,1960年由Kendraw解析出来,随后Perutz解出了血红蛋白的晶体结构。自此, X射线晶体学在蛋白质晶体结构测定方面飞速发展,成为一种非常有效的手段。到目前为止,纽约的Brookhavan国家实验室国际蛋白质结构数据库(PDB中的蛋白质数量已有一万多种。最近又出现了一种新技术-外延X射线吸收精细结构(Extended X-ray absorption fine structure,EXAFS谱,该技术不仅可以研究晶体结构,还可用来研究非晶态及溶液中的大分子,还能探测特定吸收原子周围的近邻

38、环境结构,成为研究金属蛋白质络合物的又一有力技术。如对钼铁蛋白EXAFS谱的研究表明,钼的最接近配位体是硫,从而完全否认了过去的Mo=O双键。3.5 电子晶体学与X射线衍射方法相似,电子晶体学已成为一种独立的蛋白质三维构象空间结构分析的又一重要方法126-129。剑桥MRC分子生物学实验室的Kluy和DeRosier126建立的三维重构的方法开辟了分子生物学领域中一个崭新的结构研究领域,为此Kuly于1982年获得了诺贝尔化学奖。近十年来,随着计算机图像处理技术、电子显微镜技术及蛋白质二维结晶技术的发展和完善,电子晶体学已成为一种X射线晶体学所不可替代的蛋白质空间结构分析的有效手段。另外,利用

39、分子模拟技术可以对通过X射线衍射和核磁共振等实验手段得到的蛋白质的三维结构进行精修和验证,并能根据已知的蛋白质三维结构数据库进行同源预测130-135。相信随着生物技术、计算机技术的飞速发展,对蛋白质结构的研究必将更加完善。参考文献1.王夔,生物无机化学十年进展,中国科学出版社,1997,北京9.陈文兴,沈之荃等,高等学校化学学报,2000,21(2:30610.梁宏,刑本刚等,化学学报,1999,57(2:161201(3:107915.迟燕华,李克安等,高等学校化学学报,1999,20(11:169716.周永洽,张喜全等,高等学校化学学报,1997,18(6:85117.沈星灿,边贺东,

40、梁宏等,无机化学学报,2000,16(1:7318.周永洽,太俊哲等,高等学校化学学报,1996,17(9:133119.S. Naoya, Y. Takashi, Biochemistry, 1995,34(45:1465824.周永洽,胡绪英,申泮文,高等学校化学学报,1991,49(1:5925.岳晟,仲维清,张保林,无机化学学报,1995,11(3:29030.薛德平,林华宽,王夔,高等学校化学学报,1999,20(2:16731.宋苑苑,李晓峰,吴瑾光等,无机化学学报,1999,15(4:50933.D M E Szebenyi, S K Oberdorf, K Moffat, Na

41、ture, 1981,294:32734.Horrocks W D, Mulquen P, et al. , Inorg. Chem. Acta. 1983,79:24138:124337.Aebi U, Smith P R, et al. Nature, 1980,288:29640.OHara P B, Bersohn R. , Biochemistry, 1982,21:526941.Dower S K, Dwek R A, et al. Biochem. J., 1975,149:7342.Yang P, Yang B S, Wang J L, Chin. Sci. Bull., 19

42、89,34:74744.杨频,马贵斌,杨斌盛,化学学报,1989,47(5:44345.赵雨,徐金泽等,高等学校化学学报,2000,21(12:191346.张保林,王文清,无机化学学报,1993,9(4:36947.李晓晶,王志强,张树功等,应用化学,1998,15(1:548.李晓晶,张善荣等,高等学校化学学报,1999,20(1:12749.李欣宇,张善荣等,高等学校化学学报,1998,19(12:202650.Aimi,Silvio; Digilio, Giuseppe, et al. , Biophys.J. 1999,76(5:273551.杨频,马贵斌,赵红卫,高等学校化学学报,

43、1991,12:57752.冯志祥,张树功等,高等学校化学学报,1995,16(7:99353.仲维清,张琦,唐雯霞等,无机化学学报,1997,13(3:24154.王夔,刘冬,无机化学学报,1992,8(3:22555.陈宝卫,王夔,高等学校化学学报,1991,12(7:85756.李连之,张万明,王夔等,无机化学学报,1995,11(3:26757.王夔,曾慧慧等,化学学报,1992,50(7:68558.张朝平,胡宗起等,光谱实验室,1997,14(5:159.张朝平,夏敏,光谱学与光谱分析,1996,16(5:4360.I. Koichiro, M. Isao, Biochemistr

44、y, 1988,27(11:406061.Elmottaleb A, et al., Transition Metal Chemistry, 1997,22(6:52967.李舒婷,查丹明,梁宏等,光谱学与光谱分析,1999,19(5:70072.李英奇,杨斌盛,无机化学学报,2000,16(6:93974.Shibayama,Naoya, et al. , Biochemistry, 1993,32(34:879281.Lipincott J, Fattor T J, et al., Anal.Biochem., 2000,284(2:24782.Shibayama N, Ikedasait

45、o M, et al., FEBS Letters, 1995,372(1:12683.Tetenbaum, J;Miller, LM,Biochemistry, 2001,40(40:1221586.Li, H M; Cocco, M J. et al., Biochemistry, 2001,40(22:663687.Fruskour B G, Koening J L., Advances in Infrared and Raman Spectroscopy,1975,1:8588.Koening J L , Tabb D L., Analytical Application of FTI

46、R to Molecular andBiological Systems. D. Reidel Publishing Company, 1980,241-25589.Byler D M, Brouille J N , Susi H., Spectroscoy, 1986,1(3:2990.Kauppinen J K., Anal.Chem., 1981,53:145491.Byler D M, Susi H., Biopolymers, 1986,25(3:46992.Villalain J, et al., Biochem. Biophys. Acta., 1989,978(2:30593.

47、Francoise D F, Mickel P., Biochemistry, 1990,29:877194.Zhang Y, Zhou H M. et al., Science in China, 1994,37(12:147197.Cai S W, Singh B R., Biophys. Chem., 1999,80(1:798.Gilmanshin, R; Gulotta, M. et al., Biochemistry, 2001,40(17:512799.Zhou, J B; Wang, Z. et al., Biotechnol. Appl. Biochem.,2001,33:1

48、27100.Grdadolink, J; Marechal, Y., Biopolymers, 2001,62(1:40101.Cox A, Arroyo M M, Mayo K H., Biochem. J. , 2001,357:739102.Wishart D S, Case D A., NMR Biol. Macromol., 2001,338:3104.Ye J Q, Mayer K L., et al., Biochem. , 2001,40(26:7820109.Aimi S, Digilio G. et al., Biophys.J., 1999,76(5:2735110.Ta

49、ngrea M A. et al., Biochemistry, 2001,40(18:5488111.Schweitzer-Stenner, R., J. Raman Spectrosc., 2001,32(9:711114.Berjot M, Marx J, alix A J P., J. Raman Spectrosc., 1987,18:289115.Tang Z Y, Yuan J Y, Zhou H M. et al., J. Biochem.(Tokyo, 1995,118:706 116.Xu Y M, Li L., J.Applied Spectroscopy, 1994,4

50、8:1147117.许以明等,科学通报,1987,32(8:616118.许以明等,科学通报,1987,32(12:940119.Holtz J S W, Asher S A. et al., Biopolymers, 2000,57(2:55126.Deroisev D J, Kluy A., Nature, 1968,217:130129.Kulbrandt W, Wang D N, Fujiyoshi Y., Nature, 1994,367:614131.Jones D T, Taylor W R, Thornton J M., Nature, 1992,358:86133.Zhang

51、 C T, Zhang R., Bioinformatics, 1998,14(10:19134.Sreerama, N; Venyaminov, S Y; et al., Anal.Biochem., 2000,287(2:243 135.Andersen C A, Bohr H, Brunak S., FEBS Letters, 2001,507(1:6第二章过渡金属与血红蛋白的相互作用血红蛋白(Hb是血浆红细胞内的主要蛋白质,分子量约为64500Da,由22四个亚基组成,每个亚基的多肽链均接有一辅基血红素,其中肽链由141个氨基酸残基组成,肽链由146个氨基酸残基组成,血红蛋白在体内主要

52、担负着吸氧输氧功能,这些功能与亚基血红素上Fe2+的存在密切相关。当金属离子与血红蛋白作用时,金属离子不仅与血红蛋白残基上的N、O或S等结合,还可能取代亚基血红素上的铁,引起血红蛋白结构的变化,而结构与功能密切相关,有什么样的结构就必定有什么样的功能,反之亦然。因此,要从根本上了解金属离子作用对血红蛋白功能的影响,就必须弄清楚金属离子同血红蛋白的作用机理及对其结构的影响。铜是生物体生长发育所必需的微量元素之一,铜的生物功能是多种多样的,包括运送氧气、O2-的歧化、Fe2+的氧化、单氧合作用及电子传递等,因此研究铜与血红蛋白的作用对深入了解铜的生物功能及其作用机理有重要意义。周永洽1-3、张保林

53、4等分别对过渡金属、稀土元素与血清白蛋白(HSA、BSA的结合平衡作了深入研究。人们对血红蛋白的研究主要集中在血红蛋白与O2、CO等的结合平衡或其Bohr效应5-6,或者是研究双核金属血红蛋白杂化物的氧合平衡等7-10,而对金属离子与血红蛋白的结合平衡及对其结构的影响则鲜有报导。在研究蛋白质与金属离子作用时,温度是一个重要的因素,有人1-3采用室温(20+0.5,还有人4采用37+0.5,甚至有人11在50下来研究蛋白质同金属离子的相互作用。我们对不同温度下金属离子与蛋白质的结合平衡进行了分析,确定了37+0.5为适宜的反应温度,同时这也与人体的正常生理温度相一致。平衡常数的研究常采用平衡透析

54、法、离心超过滤法、光度法等,本文采用过滤法用ICP-AES测定了Cu2+与血红蛋白结合的平衡常数及Zn2+、Ni2+存在下对Cu2+与血红蛋白结合平衡的影响,同时用FTIR光谱技术对Cu2+及Zn2+、Ni2+与血红蛋白作用生成的单核、双核络合物的结构进行了对比研究。第一节实验部分一.仪器、试剂及实验条件1.1ICP/6500电感耦合等离子体光谱仪(Perkin-Elemer, USA测定条件:正向功率:1.1千瓦;频率:27.12兆赫;冷却气:14L/min;雾化气:1.0L/min;辅助气:0.6L/min;观测高度:感应线圈上11mm;提升量:1.0ml/min;积分时间:1s1.2Ni

55、colet AVATAR 360FT-IR 红外光谱仪1.3SHZ-88-1台式水浴恒温振荡器(中国,江苏1.4pH S-10C型酸度计(中国,萧山1.5可调式电热加热器1.6待测元素分析线波长及混合标准溶液元素分析波长/ nm 检出限ug/ml 标液浓度ug/mlCu 324.754 0.0054 100.00Zn 213.856 0.0018 100.00Ni 221.647 0.0100 100.001.7. 试剂:牛血红蛋白(中国科学院上海生物化学研究所,生化试剂,冰箱保存,用前未经进一步处理;其它试剂CuSO4、ZnSO4、NiSO4、KCl、EDTA、氨水、丙酮等均为分析纯,测定用

56、标准溶液为实验室标准储备液。二.实验方法首先将CuSO4、ZnSO4及NiSO4溶解配成一定浓度的溶液,并用EDTA 标定其浓度;准确称取一定量的牛血红蛋白,用去离子水溶解(由于血红蛋白有粘性,一般要2-4h才能溶解完,所有溶液均用去离子水配制。2.1. 温度的影响分别向2.0ml 3.100810-4mol/l 的牛血红蛋白溶液中加入1.0ml 1.010-3mol/l 的Cu2+、Zn2+及Ni2+溶液,用0.1mol/l 的KCl维持溶液离子强度,加去离子水至总体积20ml,用稀氨水调节溶液pH值为7.00+0.02,置于水浴恒温振荡器中,水浴温度分别在室温(17+0.5、25+0.5、

57、30+0.5、37+0.5及42+0.5反应8h至结合平衡后(生成均匀的粉末状深棕色沉淀,上层溶液变澄清进行过滤,用丙酮洗涤沉淀数次,滤液配成100ml溶液,再稀释10倍,用ICP测定滤液中金属离子的浓度。2.2 反应时间的影响分别向2.0ml 3.100810-4mol/l 的牛血红蛋白溶液中加入1.0ml 1.010-3mol/l 的Cu2+、Zn2+及Ni2+溶液,用0.1mol/l 的KCl维持溶液离子强度,加去离子水至总体积20ml,用稀氨水调节溶液pH值为7.00+0.02,置于37+0.5水浴恒温振荡器中,分别反应2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h 后进行过滤,用丙酮洗涤沉淀数次,滤液配成100ml溶液(若滤液稍显浑浊,在配制前加1-2滴硝酸即可再稀释10倍,用ICP测定滤液中金属离子的浓度。2.3 平衡常数的测定分别向2.