第九章 酶催化反应

1、第九章 酶催化反应游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵。 2.反应之后要从反应混合物中回收有活性的酶以重复利用，在技术上有很大难度，所以难以重复使用 。 3.稳定性差，不能在有机溶剂、强酸、强碱或者高温下使用，有些酶即使在较合适的条件下使用，也会很快失活。克服游离酶缺点的方法: 1.人工合成酶 使用有机合成以及聚合物化学中的最新技术来合成具有像酶那样活性的催化剂。称这种催化剂是“人工合成酶”，这种方法难度大，成本高，工业价值不大。2. 酶的“改性”、“修饰”以适应实际使用的条 件。酶和细胞的固定化是其中一个重要方面 凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶都称为固定化酶.通

2、过适当方法制成的不溶于水的酶都能满足这一定义。固定化酶的优点: 可连续重复使用，稳定性高 由于不同领域的科技工作者共同努力，已经制得稳定的，可以反复使用不溶于水的固定化酶制品，并且，这一旨在更有效地利用酶的活性和专一性的科学技术，已发展成为一门新兴的科学酶工程学，它的研究内容包括：酶和细胞的固定化方法；固定化酶的反应动力学和扩散效应；辅酶和辅因子的固定化；酶反应器系统的设计和分析；以及固定化酶和固定化细胞的工业应用。固定化细胞技术 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展

3、起来的一项技术。 固定化细胞的优点1、与游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵具有以下优点：（1）固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应（2）可以获得更高的细胞浓度；（3）细胞可以重复使用；（4）在高稀释率时，不会产生洗脱现象；（5）单位容积的产率高； （6）提高遗传稳定性；（7）细胞不会受到剪切效应的影响。（8）发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。2、与固定化酶相比，固定化细胞具有以下优点：（1）免去了破碎细胞提取酶的手续 （2）酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少 （3）固定化细胞制备的成本比固定化酶低（4）无需辅酶再生虽然固定化细胞具有上述许多优点，但也有不足之处，具体

4、表现在：1、仅能利用胞内酶；2、细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；3、载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；4、可能有副反应。第一节 酶催化反应一、酶和细胞的固定化方法 酶的本质是蛋白质，酶的固定化实际上是具有催化活性的蛋白质的固定化。酶的催化活性主要依赖于它的特殊的高级结构-活性中心,因此在制备固定化酶时必需严格操作条件,尽可能避免酶的高级结构受损. 一般说来，酶的固定化方法有吸附法（Adsorption ）、包埋法（Entrapment ）、交联法（Cross linking ）、化学共价法（covalent bonding ）、酶的逆胶束包囊法（Encapsulation 微

5、囊束法）等。常用的载体有活性碳、多孔玻璃、纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖。海藻酸盐、明胶以及一些合成的高分子化合物等。一、酶和细胞的固定化方法 吸附法是将酶溶液与吸附剂表面接触就能达到吸附结合。是利用载体和酶表面所带电荷的静电引力使酶吸附于载体上。吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。是一种最简单、最经济的方法。 蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的.1、吸附法（Adsorption 酶的吸附剂类型1）各种矿物质以及无机载体可以用作酶的吸附剂。例如高岭

6、土、皂土、磷酸钙、多孔玻璃、氧化铝、氧化铁、氧化钛等。 矿物质和类似无机吸附剂的蛋白质结合量通常很低。每克吸附剂的吸附量通常小于1mg酶蛋白，直径100-200um不锈钢粒子在用氧化汰处理后可以成为有效的酶吸附剂。2）纤维素粉也可以作为吸附剂，酶蛋白主要吸附在纤维素微晶结构发生部分断裂的表面处。 酶的吸附剂类型3）最常用的吸附剂是离子交换剂。 如，羧甲基纤维素,DEAE-纤维素,DEAE-葡萄糖以及合成的阴离子和阳离子交换剂。多糖类的离子交换剂的蛋白质结合量很高，达到50-150mg酶蛋白/g载体。固定化氨基酰化酶是第一个用于工业生产的固定化酶，用于N-乙酰DL-氨基酸的外消旋混合物的连续拆分

7、。 离子交换剂主要靠静电吸引,缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时,这种结合发生分解.如通过化学方法增加酶蛋白上的电荷（？）则可以使这种影响得到改善。酶的吸附剂类型4）以蛋白质为吸附载体胶原蛋白法。 一般胶原蛋白预先制成膜状（胶原膜），胶原膜溶胀，然后侵入酶溶液，酶渗入膜内并被吸附，制成酶膜。也可以通过含有酶的胶原分散液进行电沉积制得。5）根据“疏水层析”的原理，也可以使一些酶吸附到N-烷基琼脂糖颗粒上。 酶的大量非极性基团与载体上的烷基相互作用产生非极性基团之间的缔合，因而被束缚于载体上。对于等电点在酸性范围的酶，这种吸附特别牢固。6）生物特异性吸附剂-伴刀豆蛋白A与琼脂糖结合的复合

8、物（主要固定以糖蛋白为结构的酶）。吸附作用是由于伴刀豆蛋白A能够与细胞表面上的单糖和低聚糖发生特异性结合。2 、包埋法-酶固定化最常用的方法。 将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法为包埋法.通过包埋，酶不再扩散到周围介质中去而底物和产物却能自由扩散。酶在包埋过程中其分子本身并不直接参与反应，除了包埋过程中的化学反应可能对酶有不利的影响或作为包埋材料的聚合物回会引起酶的变性。优点:普适性。条件温和、酶活力回收较高。缺点：包埋法对底物分子和产物分子的大小有所限制。因为当底物和产物的相对分子质量小时，扩散的阻力小。2 、 包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为：1）、微胶囊

9、法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；2）、凝胶包埋法：是在无菌条件下，将生物细胞和胶溶液混合在一起，然后再经过相应的造粒处理，形成直径为1-4mm的胶粒。常用的包埋剂为：海藻酸盐,K-角叉菜,琼脂,三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶,聚乙烯醇(PVA)等1） 海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺点:a、在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定.b、Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒的机械强度降低，最后重新溶解。所以这个包埋方法的固定化酶或细胞不能用于磷酸缓冲液中。优点:海藻酸盐

10、价格便宜、来源丰富、无毒性、操作简便、包埋条件温和。目前是应用较广泛的包埋载体之一。2）、K-角叉菜包埋法 K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.由此形成的固定化颗粒能在磷酸缓冲液和其它电介质溶液中使用，其稳定性不受影响。缺点:a、对高浓度的Na+离子敏感，颗粒机械强度将明显下降。 b、固定化温度高,需要在37-55 ，不但给操作带来麻烦，而且必然影响被包埋的酶或细胞的活性。3）、聚丙烯酰胺凝胶-最常用的聚合物载体 方法是：在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过

11、硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成的凝胶就是固定化酶。可以通过机械的方法分散成一定大小的粒子以供使用。 用聚丙烯酰胺凝胶包埋酶，其蛋白质的固定量较高，可以达到10-100mg/g单体。调节单体和交联剂的用量可以改善聚丙烯酰胺凝胶的渗透性。一般，交联剂的用量以5%最好，此时凝胶的有效孔径最小，因而渗透性最好。当单体浓度高于15%的时候，被包埋的酶活性急剧下降。缺点:丙烯酰胺对酶具有变性作用，丙烯酰胺有神经毒性。4)半透膜微胶囊法 常用的微囊胶包埋材料有火棉、尼龙、聚脲等半渗透的界面聚合物膜。如，将含有1，6-二氨基己烷的酶水溶液分散到与水不相溶的含有己二酰二氯的有机溶剂中，水相有机相界面上的

12、二胺和二酰氯发生聚合，形成一个包围在水相酶溶液珠滴外面的聚酰胺薄膜（即尼龙-6，6薄膜）。 利用界面沉淀法也可以使酶液包埋在微胶囊中。3 、 交联法 交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶分子间交联因而得到固定的方法. 交联剂:戊二醛,1，6-亚乙基二异氰酸酯，己撑二异醛,双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等 当增加双功能集团试剂的碳骨架长度时,交联剂的溶解度将减小,疏水性增加,使酶活性降低.缺点： 双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。 由于交联试剂的毒性，这一方法具有一定的局限性。 为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定

13、量的辅助蛋白。例如牛血清蛋白和明胶等蛋白质的加入往往能够提高固定化酶的稳定性。4、 化学共价法 共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合.优点: 载体与酶结合牢固,半衰期较长缺点: 化学共价法结合时反应剧烈,引起酶蛋白高级结构发生变化,回收率较低用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团:1.氨基-赖氨酸上的-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的- 氨基; 2.羧基-双羧基氨基酸:天冬氨酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的- 羧基;3.酪氨酸上的苯酚环;4.半胱氨酸上的巯基;5.羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基6.组氨酸上的咪唑基;7.色氨酸上的吲哚基 其中以氨基和羧基为最常用 对于共价偶联

14、反应的选择的原则是:应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性;反应条件必须尽可能温和;而且最好能在水溶液中进行反应.偶联反应应该对酶蛋白上某一类功能基团有很高的专一性,而对其它功能基团或水溶液几乎无负反应.共价法的主要方法: 酰化反应，芳化反应， 烷基化反 ，溴化氰法 ，重氮化反应， 硅烷基化法固定化方法的比较吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。

15、5、逆胶束酶(reversed micelles)的包囊法制备逆胶束酶系统的方法： 最常用的方法是将一个含酶水溶液注入到含表面活性剂的有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。此法可很好地控制逆胶束中水核的大小和含量。 第二种方法是相转移法。将酶从主体水溶液中转移到含表面活性剂的有机溶剂中形成逆胶束酶溶液。此法可得到较高的酶浓度。 第三种方法是逆胶束溶液与固体酶直接搅拌，使酶进入逆胶束内。此法所需时间长，酶变性失活较严重。 对于某些酶反应,如果系统中有有机溶剂的存在，将会对反应有利:1）.如果合成反应的产物在水中溶解度很小而易溶于有机溶剂，那么有机溶剂存在会改变原来的反应平衡，使合成反

16、应趋于完成。2）.产物如有抑制作用，其抑制程度与产物的浓度有关，因此产物在有机溶剂中的溶解将会减轻产物的抑制程度。3）.如果水能与反应底物、产物或其它物质起反应形成副产物，那么有机相中反应可以减少产物并提高反应收得率。4）.一般来说，酶的热稳定性与水化程度有关，不完全水化的酶其热稳定性往往较高，因此有机溶剂的存在将改善酶的热稳定性。二、固定化酶和细胞的形状及性质1、固定化酶和细胞的形状 固定化酶和细胞由于其用途和制备方法不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状等。但目前大多数制备成颗粒状珠体。2、固定化酶和细胞的性质1）最适pH 酶和细胞经固定化后，其最适pH因固定化方法不同而有一些调

17、整。如，用聚丙烯酰胺包埋的大肠杆菌中的天门冬氨酸酶和产氨短杆菌中的延胡索酸酶的最适pH向酸性范围偏移。但用同一方法包埋的大肠杆菌中的青霉素酰胺酶的最适pH则没有变动。2、固定化酶和细胞的性质 2）、温度 类似与pH，酶和细胞固定化方法不同，也有可能导致最适温度产生不同的变化。 3）、稳定性 一般而言，酶和细胞经固定化后，其稳定性会有所提高。第二节 微生物的转化 微生物的转化（也叫生物转化biotransformation或bioconversion）：是由微生物进行的化学反应。反应被微生物细胞中的酶催化。 微生物转化技术的目的是：利用细胞酶催化有用的化学反应，所利用的是完整的细胞中酶的活性。这

18、些细胞可以是活细胞正在生长的或静态的（细胞分裂很少或者根本没有）细胞，也能使用干细胞或孢子，不管它们是否存活。微生物转化与化学合成比较，有以下优点：1）微生物转化在温和的条件下进行，化学物质可以直接转变成要求的产品，不产生分解，而且节约能源和投资。2）微生物转化作用于基质分子的专一位置，产生立体专一性、光学专一性产物，不需要化学拆分。一、微生物转化的一般过程1、制备培养系统：选择优良的培养物，使其生长在合适的环境中，达到足够量的菌体，作为生物转化反应的催化剂。2、加入底物：底物加入的时间与方法是重要的考虑因素。3、加入效应物：效应物是反应后未改变的化合物。效应物分抑制剂和激活剂。加入抑制剂可以

19、有效抑制副反应。这些化合物加入的时间和方法也十分重要。4、保温反应：在合适的环境条件下进行保温，直至转化反应完成。5、监测反应过程：间歇取样并监测底物与产物水平、PH、细胞量、能源和其它参数。6、终止反应：当样品分析表明产物积累停止，则移去活性细胞，停止反应。7、产物分离：生物转化的溶剂主要是水，产物在水中浓度相对较低，经过分离和纯化得到产物。二、微生物转化的培养系统类型 生物转化过程中有许多利用细胞的途径，每种都有其优缺点。1、分批培养：是一个直接的、传统的方法，这种方法包括培养基的准备、接种、细胞培养、底物加入、保温直至反应完成。 接种的时间一般是对数生长期的中期到后期。如果接种培养基和生

20、长培养基不同，可以考虑收集并洗涤细胞，然后将它们悬浮在水中或生理盐水中，可以避免种子培养基的干扰。2、连续培养：通过连续加入新鲜培养基和等速率移去消耗了的培养基，使细胞在相对长的周期内维持稳定状态。 在恒化培养中，将一种或两种营养设计为限制性营养，使生长速率被新鲜培养基加入速率所控制。如果反应物对菌体有毒性，可以控制反应物加入的速率，降低毒性影响，得到较高的转化率。3、静息细胞：是有生命的不生长的细胞，它保持许多酶的活性。 在适当的培养基中，菌体扩大培养到一定的时间，用过滤或离心进行分离，收集菌体将其悬浮在不完全的培养基中（如没有氮源的培养基），加入底物。在一定温度、PH、通气搅拌下转化反应。

21、这种方法的优点是可以自由地改变反应液中底物和菌体的比例，反应时间较短，转化生成物中杂质较少，分离提纯容易。4、干细胞：是静息细胞的另一种形式。用一定的干燥方法使微生物细胞存活或起码有多种酶的活性存在。最常用的方法是冻干或丙酮处理。冻干是用于包藏培养物广泛应用的一种干燥方法。冻干的操作是：将离心或过滤得到的细胞，经过洗涤，悬浮在稀缓冲液和水中，悬浮液装入圆底烧瓶或安剖瓶中，低温冷冻成一薄层，在高真空下移去水分，得到蓬松的干粉末。丙酮粉制备：浓细胞悬浮液中加入三倍以上冷（-20）丙酮，细胞在丙酮中成浆后，抽滤（？）得到丙酮干粉，丙酮粉保存在冷冻条件下。 用干细胞粉的方法与用新鲜静息细胞相同，但干粉

22、保藏起运输方便，不需要保持无菌条件就可以进行生物转化。5、孢子：悬浮在培养基中的孢子能用作生物转化活性相对稳定的来源，但是孢子不能发芽？，真菌的分生孢子和子囊孢子可以很方便的进行生物转化。 利用孢子悬浮液生物转化，类似静息细胞的方法。培养基中含有缓冲液和能源，如葡萄糖，但是氮源方面不完全。在这样的培养基中加入底物，在适当的温度和搅拌下进行转化，孵化中的孢子是1×108- 1×109孢子/ml，PH要求5-6，可以抑制细菌的生长。在这种孵化条件下刨子通常不发芽。 收集孢子的方法：用稀的表面活性剂如0.01%Tween80洗涤培养物表面，用无菌针或杆轻柔刮下孢子，然后离心收集，

23、得到孢子糊状物保藏在-20。6、渗透细胞：是用表面活性剂或溶剂处理细胞，改变细胞渗透性，使底物和产物进出细胞更容易。 如用青霉素。可以影响细胞壁合成，从而提高渗透性，在谷氨酸生产中应用这种方法，提高了谷氨酸的产量。但是，一定要控制加入表面活性剂或溶剂的量，细胞可能因为渗透性的改变，而剧烈影响细胞的生存。7、固定化细胞：是固定或结合在表面，或包埋在凝胶基质中的细胞。可以保持活性几个月，比静息细胞催化寿命长。聚丙烯酰胺法：10g/40ml生理盐水的细胞悬浮液，加7.5g丙烯酰胺，0.4g N,N-亚甲基二丙烯酰胺，5ml B-二甲酰胺丙腈和5ml2.5%过二硫酸钾，温度不超过四十度，稳定10-15

24、min，将变硬的胶切成2-3mm的小块，包埋的细胞彻底洗净，用于转化。卡拉胶法：将活性细胞换副在5ml0.9%盐水中，卡拉胶1.7g溶解在34ml45-60的盐水中。两种流体混合，冷却到10 。胶的强度在冷的0.3mol/L氯化钾中增强，得到颗粒状的硬胶。8、渗透交联固定化细胞 胞内酶的固定化存在很大的难度。这种方法是先用某些试剂（多为表面活性剂）处理细胞，提高细胞的通透性，再进行交联固定化，可以保证酶活力破坏较小，有减小了传质阻力。既克服了提取酶中破碎细胞后的提取难度，又避免了固定细胞中底物与酶接触难的传质阻力限制问题。三、底物加入底物是被生物转化的基质,包括水溶性的和水不溶性的.1、水溶性

25、底物的加入：水溶性底物与细胞接触容易. 根据化合物的性质,不带电的化合物底物的加入量最高为10%左右.离子化合物底物的加入量最高为5%左右.2、水不溶性底物的加入 在反应系统中存在两种以上的固相物，传质问题成为限制性因素。在实践中常常采用的方法是：1）将不溶性底物磨成细小的粉末加入。当不溶性的气体作为底物时，可采用鼓泡进入培养系统。在甾体转化的许多例子中，都采用磨成细小的粉末种方法。2）将不溶底物溶在与水互溶的有机溶剂中。常用的溶剂有乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜。用这些溶剂制成非常浓的溶液，值得注意的是要测定系统对溶剂的忍受性，并且加入溶剂的量要尽可能的少。3）用表面活性剂来分

26、散不溶性物质。表面活性剂可以直接以液体或粉末形式加入，也可以溶解后加入。无毒害的表面活性剂有Tween和Brijs，对于非生长细胞也可以用有毒性的表面活性剂Triton-10C。4）如底物对微生物有毒性，可以选用适当的吸附剂，底物吸附在表面，减小反应液中 底物浓度，降低对微生物的毒性影响。常用的吸附剂有活性炭和聚苯乙烯。5）有些底物是酶的诱导物，早期加入对细胞有毒性，必须待微生物生长到对数生长期后期才可以加入。四、微生物转化的类型1、氧化：氧化是生物转化最常见的反应，包括： 羟基取代氢；双键打开，接上羟基或酮基；氨基氧化成羟基等。2、还原：包括双键加氢，去羟基等。3、氨基化：主要在氨基酸的合成

27、中。4、乙酰化和去乙酰化5、脱氢形成双键。在甾体转化中应用很多。6、腈转化为酸7、光学专一和立体专一转化与拆分。五、微生物转化的应用 主要在甾体、抗生素、维生素、生物碱、药物和化学制品方面有广泛的应用。 生物碱的化感作用第三节 非水相酶催化一、非水相酶催化的特性 酶在有机溶剂中进行的催化反应，由于有机溶剂中许多工业应用价值比较大的物质溶度大大增加，且增加了稳定性， 所以应用较广。在有机相中进行酶催化有以下几个特性：1、增加非极性基质的溶解度2、使某些原本在水相中不能进行的反应顺利进行，如肽类和脂类的合成。3、可减少在水相极易发生的副反应，如酸酐的水解，卤化物的水解和醌的聚合稳定性（比水溶液中）

28、好。4、在有机溶剂中可以改变基质的专一性。5、酶在有机溶剂中由于本身是不溶的，故不再需要如水相的固定化等，在反应结束后容易（往往只需要过滤）使酶从体系中分离出来。6、若因从流速等许多方面考虑酶确实需要固定化，则利用固定化的载体只需要简单的非极性表面（如玻璃珠）即可，在非水介质中，酶不会从载体表面脱落.7、产物很容易从低沸点、高蒸汽压的溶剂中得到回收.8、在有机溶剂中酶的热稳定性（比水溶液中）好。9、有机相酶反应无微生物的污染。10、有可能使酶直接应用于某些化学反应中。二、非水相酶催化的一些基本原理 酶在有机溶剂中的能力已经得到大大扩展，使原本在水相由于受动力学或热力学影响难以完成的实验得到完成

29、，在非水相中酶有如下几个方面的特性。1、酶在有机溶剂中的结构特点和稳定性 酶作为具有催化活性的蛋白质在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在，这种结构与构象是酶发挥催化功能所必须的“紧密”而又有“柔性”的状态。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，在水溶液中，水分子与蛋白质分子内的氢键的形成，使蛋白质内的氢键收到破坏，蛋白质结构变的松散。1、酶在有机溶剂中的结构特点和稳定性 而当酶悬浮在有机溶剂中时，蛋白质内的氢键占主导地位，导致蛋白质结构变的刚硬，蛋白质的这种热力学刚性限制了疏水环境下蛋白质构象向热力学稳定状态的转化，能维持着和水溶液中同样的构象和机构、不变性和催化活性。酶在有机溶剂中热稳

30、定性和储存稳定性都有明显提高。大量的实验证明：水溶性的酶悬浮与苯、正己烷等有机溶剂中不变性，还能表现出催化活性。2、酶催化反应中的水的作用 酶分子极大程度的直接或间接与水作用，这些非共价的作用包括静电作用、范德华力、疏水作用和氢键，所有这些均使酶分子周围形成一个水合层，使其具有一个催化活性的正常的酶构型。如果用有机溶剂取代酶周围的水，酶分子的天然结构会被破坏，导致酶失活。在完全干燥的情况下，酶是无活性的，极少量的水（基本水）会激发酶的活性，只有被酶吸附的水才会对酶的催化活性有影响，适量的水可使酶活性增高，但是过量的水会使酶活性下降（？）。只有在最适水量时，蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之

31、间达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。3、有机溶剂对酶促催化反应的影响 有机溶剂对酶活性的影响有多种方式：影响酶的基本水合层、改变蛋白质结构和柔韧性或者改变酶的表观动力学。 1）有机溶剂与酶基本水合层中的必须水反应。有机溶剂可能直接与酶分子水合层中的必须水发生反应，影响酶的结构和功能，尤其是极性较强的溶剂，他可以溶解大量的水，将酶分子水合层中的必须水剥离掉，导致酶失活。相对来讲，憎水性溶解对水的溶解能力较低，故对酶活和结构影响较小。2）、有机溶剂有可能直接与扩散在其中的基质或产物发生反应，从而减慢反应速率；溶剂有可能直接与酶蛋白发生反应而抑制酶活甚至使酶失活，溶剂有可能与酶分子的氢键、离子键、憎

32、水基团等发生反应从而改变酶蛋白的天然构型，而当酶溶解在有机溶剂中，这种现象尤为严重。酶在有机溶剂中呈现刚性结构，可使其对基质的专一性发生变化，刚性愈强，对接受较大的基质的能力下降。酶在水溶液中蛋白质的折叠结构被打开而导致酶分子三级结构发生变化，而酶在有机溶剂中热稳定性就增加了。4、有机相反应中酶的制备及化学修饰 1）有机相酶反应中酶的制备： a、直接冻干成酶粉或酶的晶体参与反应。由于酶在大部分有机溶剂中是不溶的，当然在冻干过程中对含水量和酶液PH值采取了最大优化，使其能发挥最佳的催化活力。 b、采用将酶固定化在诸如玻璃珠等固体多孔物质上，以克服游离酶在有机溶剂中的内扩散现象。固定化的好坏与孔径

33、、表面积、对水和基质的分配系数相关。2）有机相酶反应中的化学修饰：通过化学修饰，使酶充分溶解在有机溶剂中，与基质充分结合，使酶的催化活性提高。可以通过以下三种方式对有机相反应中的酶进行化学修饰。a、可以采用共价修饰使酶溶剂在有机溶剂中。PEG被广泛应用于有机相酶反应中对酶的修饰。其原理是基于PEG这一双亲分子能修饰酶分子的表面，增加酶表面的疏水性，使酶均一的溶于有机溶剂，提高酶的催化效率和稳定性。聚苯乙烯、聚丙乙烯都可做共价修饰剂.b、非共价复合物的形成也可使酶溶解于有机溶剂中，表面活性脂类也是很好的修饰剂。c、酶在微囊中亦可以使酶溶解在有机溶剂中。三、非水相酶催化反应的应用 利用有机相酶催化

34、反应最主要的优点是将原先在水相中热力学平衡向水解方向的反应转化为合成反应。第十章 动物细胞培养动、植物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞植物细胞细胞壁普遍存在存在普遍存在生长速率快,倍增时间0.5-5h慢,倍增时间15-100h慢,倍增时间24-74h需氧量高低低营养要求普遍简单非常复杂较复杂细胞和产物浓度较高低低环境影响不敏感非常敏感能忍受广泛的范围大小范围0.1-10um10-100um10-100um传统变异、筛选技术广泛使用不常使用有时使用悬浮生长可以多数细胞需附着表面才能生长可以,但易结团,无单个细胞代谢调节内部内部、激素内部、激素剪切力敏感低非常高高细胞分化无有有动物

35、细胞培养是指在体外培养动物细胞，是一种离体培养技术，有以下几点好处：1）简化了环境条件，排除了体内实验受到的各种复杂因素的影响，便于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的基本规律.2）便于利用各种技术和方法研究和观察细胞结构与功能的变化。3）可以在长时间内研究和观察细胞遗传行为的变化.4）可以同时提供大量生物性质相同的细胞，特别是人的或细胞作为研究对象，不仅成本低，而且解决了不能用人做实验的问题。用动物细胞生产产品，是近年来生物技术工业中一个十分重要的组成部分，其产品可以分为三类：1）动物细胞可以自然合成或在外源基因指导下合成许多分泌产物，其中许多被鉴定为很有潜力的治疗药物

36、。如单克隆抗体、干扰素、EPO，tPA等.2）用动物细胞作为宿主，可以生产其他生物体，如病毒疫苗就是迄今生产规模最大的细胞培养产品.3）有的细胞本身就是产品，用于皮肤或骨髓移植、基因治疗等。某些有用大分子可以从培养的细胞体中提取。4）培养细胞还可以用于抗癌药物的筛选和毒性测定.一、细胞培养物的特性：1 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2 细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差。3 需氧少，不耐受强力通风与搅拌4 群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5 培养过程产品分布细胞内外，成本高 6 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡第一节 细胞培养物的特性一、细胞培养物的特性几个易混淆的概念

37、动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。与细胞培养密切相关的还有组织培养和器官培养，不可混淆。 动物组织培养是指动物组织在体外体外条件下保存或生长，此时可能有组织分化，并保持组织的结构和功能。 动物器官培养是指器官的培养、整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存或生长，此时也有器官的分化，并保存器官的三维立体结构和功能。细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。如果不能继续传代或传代次数有限，成为有限细胞系。如果可以传代成为连续细胞系，即已建成细胞系。有限细胞系经过几次传代培养后会死亡或转化成

38、连续细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。二、动物细胞形态和生长类型(1)成纤维细胞型(fibrlblast或mechanocyte type)：这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。实际上很多所谓成纤维细胞并无产生纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法。(2)上皮细胞型(

39、epithilium cell type)：这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。培养时皆呈上皮型。二、动物细胞形态和生长类型3)游走细胞型(wondering cell type)：这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能变为成纤维细胞型。(4)多形性细胞型(polymorphi

40、c cell type)：除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞。 上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生长。但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。(5)悬浮型细胞：这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。二、动物细胞形态和生长类型细胞生长的类型贴壁依赖性细胞是指需要贴附到固体介质上才能生存和生长的细胞。来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的，必须贴伏在

41、合适的固体介质上并铺展，才能生长。 非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。非帖壁依赖型细胞在静止培养中，有的细胞可不牢固地贴附在固体介质上。贴壁依赖性细胞的生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。动物细胞贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过

42、滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。动物细胞贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大； 占地面积大； 不能有效监测细胞的生长；细胞分化(cell differentiation)：细胞分化是指生物个体发育过程中，通过细胞分裂在细胞之间产生形态结构功能上稳定性差异的生命活动过程。在形态结构功能上有了稳定性差异的细胞，称之为分化细胞。细胞分裂是细胞分化的基础，而两者又是多细胞生物个体发育的基础，个体发育是通过细胞分裂、细胞分化和细胞死亡三种生命活动得以实现。 通过细胞分化，使具有相同遗传组成的细

43、胞，选择性地表达不同的基因，产生不同的结构蛋白、执行不同的功能，共同参与构成一个复杂的细胞社会个体，所以细胞分化的实质是基因的差别表达（differential expression）。细胞分化与形态发生（morphogenesis）是相互联系在一起的，后者是指通过细胞的增殖、分化和行为（如粘附、迁移、凋亡）塑造组织、器官和个体形态的过程。 单克隆抗体： 单克隆抗体是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体/多株抗体由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能

44、产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。当其应用于医疗中时，在识别抗原中的显示的微小变化(如果有的话)有助于减小副作用。第六章 种子扩大培养种子扩大培养的概念: 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 种子扩大培养的目的q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理性状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。 种子制备工艺实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。一、实验室种子制备实验室种子的制备一般采用两种方式： 1、对于产孢子能力强的及孢子发芽、