羟乙基淀粉(13004)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护

1、羟乙基淀粉(130/0.4)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护周大春 马晓旭 谢俊然 罗丰 金梅浙江大学医学院邵逸夫医院【摘要】 目的 观察新一代羟乙基淀粉（130/0.4）对肾缺血再灌注损伤和免疫粘附分子ICAM-1表达的影响。方法 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，在缺血结束前开始输液治疗。随机分为假手术组（C组）、生理盐水组（S组）和羟乙基淀粉治疗组。后者又按剂量分为W1组（5ml/kg）、W2组（10ml/kg）和W3组（20ml/kg）。再灌注24h后对比肾功能、肾小管损伤（Paller评分法）和肾组织ICAM-1表达。结果 缺血再灌注后肾功能受损，肾小管肿胀变性，ICAM-1表达明显增强。

2、W2、W3组病变明显减轻，ICAM-1表达少于S组（P<0.01）。但W1组与S组差别不显著。结论 输注1020ml/kg羟乙基淀粉（130/0.4）可以明显减轻大鼠肾缺血再灌注损伤。抑制ICAM-1表达和活性是其可能的机制之一。【关键词】 羟乙基淀粉；肾；再灌注损伤；胞间粘附分子1Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of rat renal ZHOU Da-chun, MA Xiao-xu, XIE Jun-ran, LUO Feng, JIN M

3、ei. Department of Anesthesiology, Sir Run Run Shaw Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310016 China【Abstract】 Objective To explore the Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of rat renal and the role of intercellular adhesion

4、 molecule-1(ICAM-1). Method On a rat renal ischemia reperfusion model, animals were randomly assigned to receive sham surgery as control(Group C),normal saline(group S),HES 5ml/kg (group W1), HES 10mg/kg (group W2) or HES 20ml/kg(group W3). After reperfusion for 24h, renal function, renal tubular in

5、jury (Pallors scoring) and ICAM-1 expression were compared. Results Ischemia reperfusion impaired renal function, caused severe tubular damage and increase ICAM-1 expression. These changes were reduced in group W2 and W3 but not at W1. Conclusions Infusion 10-20ml/kg of hydroxyethyl starch (130/0.4)

6、 reduced ICAM-1 expression and was protective for rat renal against ischemia reperfusion injury.【Key words】 Hetastarch; Renal; Reperfusion injury; Intercellular adhesion molecule-1 羟乙基淀粉(130/0.4)对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of

7、 rat renal周大春 马晓旭 谢俊然 罗丰 金梅缺血再灌注损伤是器官移植、休克、动脉搭桥术后普遍存在的问题，肾脏作为高灌注器官，是发生缺血再灌注损伤的常见重要器官之一。免疫粘附分子及其介导的白细胞与内皮细胞粘附作用是缺血再灌注损伤的关键因素1,2。羟乙基淀粉(HES)作为临床常用的人工胶体，已被广泛用于容量治疗。本文观察新一代羟乙基淀粉（130/0.4）对大鼠肾脏缺血再灌注损伤和肾脏免疫粘附分子（ICAM-1）表达的影响。1 材料和方法11 材料 健康成年SD大鼠，雌雄不拘，体重200260g，由浙江大学医学院实验动物中心提供，ICAM1免疫组化试剂盒( G25):SC28439购于R&

8、amp;D systems，DAB显色试剂盒购于中杉金桥公司。1.2 方法1.2.1 动物模型及分组 50只SD大鼠，随机分为5组，每组10只,均以3水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉后按无菌手术操作，左颈部切口，分离颈动脉插入24G套管测平均动脉压。四肢皮下针电极穿刺连接八道生理记录仪监测心电图和心率。直肠置探头测体温，采用加热灯进行保温，维持体温于3839。以上指标采用澳大利亚拜普医研设备公司生产的Powerlab/8SP八道生理记录仪记录各参数。经腹正中切口暴露双侧肾脏，分离左肾动脉，切除右肾。经左侧股静脉置入24号套管针连接微量注射泵。各组处理分别如下：C组：假手术对照组，进行手

9、术但不夹闭肾动脉；S组：生理盐水对照组，夹闭左肾动脉60min，在开放肾动脉前20min开始输注生理盐水20ml/kg；W组又分为3个亚组，为W1、W2和W3组，各组均夹闭左肾动脉60min，在开放肾动脉前20min分别输注HES(130/0.4)（130/0.4）5ml/kg、10ml/kg和20ml/kg。生理盐水和不同剂量的羟已基淀粉的输注速度均为0.2ml/min3。 1.2.2 生化检测 各组动物于再灌注后24h取动脉血2ml采用全自动生化分析仪测定血清肌酐(Cr)和尿素氮（BUN）。1.2.3 肾脏组织形态学观察 再灌注后24h取肾脏组织，10中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm

10、厚的切片，HE染色，在普通光学显微镜下观察，每个视野选择10个小管评分，按50个肾小管计分(即5个视野)，其标准依据4Paller法，肾小管明显扩张，细胞扁平1分，刷状缘损伤或脱落1分或2分，管型2分肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片1分。1.2.4 ICAM-1免疫组化染色及其定量分析 肾组织中ICAM1检测方法为二步法: 石蜡片脱蜡置蒸馏水； PBS 冲洗3 min ×3 次； 置3 %过氧化氢甲醛溶液中20 min ； PBS 冲洗3 min ×3 次； 每张切片滴加第一抗体,置4 冰箱过夜； PBS 冲洗3 min ×3次； 滴加酶标记的第二抗体孵

11、育40 min ； PBS冲洗3 min ×3 次； (9) 新鲜配制的DAB 溶液显色310 min，用水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明,中性树胶封固。在光学显微镜400倍下每张切片随机选择5个视野，用HHAS1图像分析系统计算光密度值作为半定量参数，测量ICAM1的表达。 统计学分析：实验数据用均以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，用SPSS13.0统计软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学意义。2、结果2.1 各组动物在输注生理盐水或HES(130/0.4)前后平均动脉压（MAP）和心率（HR）没有显著差异。见表1。2.2 HES(130/0.4

12、)对肾功能的影响：再灌注24h后S组血清肌酐和尿素氮显著高于C组；输注HES(130/0.4)10ml/kg和20ml/kg可显著改善再灌注后的肾功能损害（P<0.05或P<0.01），5ml/kg剂量组与S组比无明显差异。见表2。2.3 肾组织学变化：再灌注24h后，光镜下S组肾小管上皮细胞肿胀，出现不同程度的变性与坏死，肾小管刷状缘脱落或部分脱落，以近曲小管为甚，并见管型，肾间质局部出血水肿及炎性细胞浸润。W2和W3组的病理改变较S组明显减轻光镜下见肾小管上皮细胞肿胀、变性和坏死明显减轻，肾小管Paller评分也少于S组（P<0.05或P<0.01），肾间质炎症细胞

13、浸润也减少；W1组与S组相比无明显统计学差异。(图1和表3)2.4 肾组织ICAM-1表达：C组肾脏ICAM-1仅在肾髓质直小血管、肾小管周围毛细血管少量表达。肾小管上皮不表达或低水平表达。再灌注后24h，S组肾脏ICAM-1表达明显增强，且可见于肾小球毛细血管、系膜区及肾近曲小管上皮细胞。W2和W3组ICAM-1表达显著少于S组（P<0.05或P<0.01），W1组与S组相比无明显差异。（图2和表3） Tab 1 change of MAP and HR during renal ischemic reperfusion injury，(IRI)（x±s, n=10）I

14、tem MAP(mmHg) HR After infusion Before infusion(次/min)After infusionGroup Before infusionGroup C87.4±9.288.2±7.9298±21287±19Group S89.6±11.288.3±10.7283±14285±12Group W187.6±7.987.8±11.2277±11275±13Group W286.9±8.787.2±10.0275

15、7;9280±20Group W389.6±11.089.3±8.7281±21284±19Tab 2 Change of renal fuction after renal IRI and tread with Hydroxyethyl Starch（x±s, n=10）BUN （mmol/L）Cr（mmol/L）Group C26.71±4.42 0.81±0.31Group S151.71±22.473.17±1.00Group W392.14±27.71*#1.57±

16、0.70 *#Group W298.85±22.87*#1.82±0.86 *#Group W1135.85±14.473.04±.29*P<0.05, * P<0.01 VS group S； #P<0.05, #P<0.01 VS group W1Tab 3 Change of Pallers score and mean density of ICAM-1 afterrenal IRI and tread with Hydroxyethyl Starch（x±s, n=10）PallerscoreICAM-1(de

17、nsity）Group C1.36±1.57105.02±23.55Group S43.20±15.75212.70±32.29Group W329.16±12.27*#161.24±25.32*#Group W233.56±16.62*182.00±21.94*Group W141.12±15.59214.08±33.87*P<0.05, * P<0.01 VS group S ；#P<0.05, #P<0.01 VS group W13 讨 论肾脏缺血再灌注损伤是临床

18、普遍存在的问题，在器官移植、失血性休克、动脉搭桥手术等过程均可以发生。HES 200/0.5是临床常用的血浆扩容剂，有关多次使用后血浆组织蓄积问题、对凝血功能和肾功能的影响问题日益凸现， HES (130/0.4)是新一代羟乙基淀粉，其在分子量、取代级以及取代方式上改进的优化组合使其更安全、有效。在容量治疗中发挥更大的作用5，7。本研究通过肾脏缺血再灌注损伤动物模型研究了不同剂量的HES(130/0.4)对肾脏缺血再灌注损伤的影响以及可能的机制。结果表明一定剂量的HES(130/0.4)可以明显改善肾脏缺血再灌注损伤,而且在一定范围内,这种保护作用随HES(130/0.4)剂量的增加而增加。对

19、于肾脏缺血再灌注损伤机制的研究涉及许多方面，其中免疫粘附分子（ICAM1）在肾脏缺血再灌注损伤中具有重要的作用 2,8 。ICAM1是表达于内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞及各种白细胞上的一种膜糖蛋白，是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间粘附的重要生物分子。其在机体的炎性反应和免疫应答中起着非常重要的作用9 。有研究发现肾脏缺血再灌注后内皮细胞粘附分子的表达明显增加，而在体采用ICAM1 抗体或ICAM1 表达缺失小鼠肾组织髓过氧化物酶活性增加受抑制,肾功能明显缓解 10,11 。本实验也证实再灌注后24h肾脏ICAM-1表达明显增强，且可见于肾小球毛细血管、系膜区及肾近曲小管上皮细胞，而正常

20、肾脏ICAM-1仅在肾髓质直小血管、肾小管周围毛细血管少量表达，在肾小管上皮不表达或少量表达12，13。输注一定剂量的HES(130/0.4)能明显抑制缺血再灌注损伤后ICAM1在大鼠肾脏的表达；肾脏功能和肾脏组织形态学都有明显改善。缺血再灌注可激活肾脏内皮细胞和炎症细胞，使粘附分子的表达升高，促进白细胞在血管内皮的附着；此外，活化的炎症细胞和内皮细胞也可以激活补体系统，使局部组织炎症介质增加,如细胞因子、肿瘤坏死因子( TNF) 、白介素( IL) 、血小板激活因子、花生四烯酸的代谢产物以及活性氧代谢产物等。这些炎症因子又可以强化粘附分子表达和粘附力22。从而导致中性粒细胞在局部聚集和粘附，

21、于外髓形成梗阻，白细胞介导的内皮通透性增加,红细胞凝聚，导致再灌注后的肾脏外髓失灌注或灌注不足，而且浸润、激活的白细胞还可导致直接的组织损伤10 进而造成器官功能损伤14 。HES(130/0.4)是一种天然的多糖，其不仅可以抑制内皮损伤所致的ICAM1的表达，减少粘附分子的分泌，还可以通过直接抑制整合素介导的相互作用减轻白细胞的粘附15,16，同时也可以抑制缺血再灌注后内皮细胞过度活化，下调全身炎症反应和保护内皮细胞功能17，从而发挥其抑制白细胞、血小板的粘附和激活，减轻毛细血管损伤所致的通透性增加，达到对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。该点与Collis等人使用HES进行的离体实验结果相吻合

22、18。HES(130/0.4)虽能减轻肾组织缺血再灌注损伤，对肾功能恢复有促进作用，但并不能完全阻断其损伤，这也从另一侧反映了肾脏缺血再灌注损伤机制多方面性。也有研究认为HES(130/0.4)可以改善微循环，减少并带走组织缺氧产生的代谢产物,增加组织供氧19，20。这在一定程度上也可以改善缺血再灌注后肾脏功能和组织形态学表现。此外，输注一定量的HES（130/0.4）可以稀释血液，血液稀释以后，肾皮质血流增加，急性期的髓质缺血肾脏髓质渗透梯度下降，肾小管重吸收减少，尿量增加，冲洗了肾小管的内毒素和可能形成的管形，从而保护了肾脏功能，改善长期预后21。与S组相比，HES(130/0.4)5ml

23、/kg剂量组虽然在肾脏功能、组织形态以及ICAM1在肾脏的表达方面均有所改善，但是没有明显的统计学差异。这可能与选择的剂量小有关。本实验只选择了肾脏缺血再灌注后损伤比较严重的时间点进行研究，没有选择多个时间点动态观察HES(130/0.4)对缺血再灌注损伤的影响以及与ICAM1表达的关系。总之，一定剂量的HES(130/0.4)可以明显改善大鼠肾脏缺血再灌注损伤，抑制肾脏ICAM1表达和活性是其改善缺血再灌注损伤的可能机制之一。图1. 大鼠皮质肾小管（HE染色，1：400）。1A假手术组；1B生理盐水组，肾小管上皮细胞肿胀，变性与坏死，并见管型；1C HES 5ml/kg，1D HES 10m

24、l/kg，1E HES 20ml/kg，肾小管上皮细胞肿胀、变性和坏死明显减轻。 图2. 大鼠皮质肾小管ICAM-1表达（免疫组化，1：400）。1A假手术组；仅在肾髓质直小血管、肾小管周围毛细血管少量表达；1B生理盐水组，表达明显增强；1C HES 5ml/kg，1D HES 10ml/kg， 1E HES 20ml/kg，表达显著少于S组。 参考文献1 Bonventre JVMechanism of isehemic acute reDAtfailureJKidney In 1993，43：11601178 2 Rabh H, OMeara YM, Maderna P et al. Le

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