第10章 经典液相色谱法ppt课件

1、 经典液相色谱法 药物分析教研室 本章内容本章内容第第1 1节节 液液- -固吸附柱色谱法固吸附柱色谱法 第第2 2节节 液液- -液分配柱色谱法液分配柱色谱法 第第3 3节节 离子交换色谱法离子交换色谱法 第第4 4节节 空间排阻色谱法空间排阻色谱法 第第5 5节节 薄层色谱法薄层色谱法 第第6 6节节 纸色谱法纸色谱法 要求要求 1.掌握液相色谱技术的掌握液相色谱技术的基本原理。基本原理。 2.熟悉吸附等温线。熟悉吸附等温线。 3.了解液相色谱技术的了解液相色谱技术的基本操作。基本操作。 概概 述述定义定义 分类分类 按操作形式按操作形式 按分离机理按分离机理 按分离效率按分离效率定义：定

2、义：以液体为流动相的色谱法以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。称为液相色谱法。 柱色谱法操作形式 平面色谱法 吸附色谱法 分配色谱法分离机理 离子交换色谱法 空间排阻色谱法 经典液相色谱法分离效率 现代液相色谱法 经典液相色谱法：经典液相色谱法： 是在常压下靠重力或毛细作用输是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法。送流动相的色谱方法。 经典柱色谱法经典柱色谱法 平面色谱法。平面色谱法。 经典与现代的区别主要在：经典与现代的区别主要在： 输送流动相方式输送流动相方式 固定相规格固定相规格 分离效能分离效能 分析速度分析速度 检测灵敏度检测灵敏度 第第1节节 液液-固吸附柱色谱法固吸附柱

3、色谱法 一一. 基本原理基本原理 二二. 吸附剂吸附剂 三三. 色谱条件的选择色谱条件的选择 四四. 操作方法操作方法 吸附色谱法：一种溶质基于吸吸附色谱法：一种溶质基于吸附现象而获得分离的液附现象而获得分离的液-固色谱固色谱分析方法。分析方法。 用于分离分析极性至弱极性的用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强化合物，不适用于分离分析强极性的物质。极性的物质。 经典的液经典的液固吸附色谱固吸附色谱LSC）：）： 以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分析的方法。的差异，进

4、行分离分析的方法。 柱色谱法：柱色谱法： 将固定相装于柱管内就构成色谱柱，将固定相装于柱管内就构成色谱柱，色谱过程在柱内进行的一类色谱方法。色谱过程在柱内进行的一类色谱方法。 根据根据 吸附过程的两个规律：吸附过程的两个规律： 1 )吸附剂对不同物质的吸附吸附剂对不同物质的吸附行为有差异。行为有差异。 2 ) 吸附过程是可逆的，存吸附过程是可逆的，存在着吸附在着吸附 解吸附的动态解吸附的动态平衡。平衡。 一一.基本原理基本原理（一吸附与吸附平衡（一吸附与吸附平衡（二吸附等温线（二吸附等温线（一吸附与吸附平衡（一吸附与吸附平衡流动相通过固定相时，吸附剂表面流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心

5、吸附流动相分子，当组的活性中心吸附流动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分分子进入柱子时，会赶走流动相分子而占据吸附剂的活性中心位，分子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附。即组分被吸附。反之，溶剂分子也可把溶质分子赶反之，溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸附。走，即解吸附。 吸附平衡常数吸附平衡常数K Cs为溶质在固定相的浓度为溶质在固定相的浓度 Cm为溶质在流动相中的浓度。为溶质在流动相中的浓度。 吸附平衡常数吸附平衡常数K是与组分的性是与组分的性质、吸附剂和流动相的性质与质、吸附剂和流动相的性质与温度有关的一个常数。温度有关的一个常数。mms sC CC C溶质在流动相中的浓度

6、溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度K K 不同溶质不同溶质K值不同，值不同，K值决定色谱值决定色谱特性。特性。 K值大，吸附牢移动速度慢，较后值大，吸附牢移动速度慢，较后洗出；洗出； K=0，不被固定相吸附。，不被固定相吸附。 在进行色谱条件选择的时候，要在进行色谱条件选择的时候，要尽量使混合组分的尽量使混合组分的K值相差较大，值相差较大，混合样品就可以达到分离。混合样品就可以达到分离。 （二吸附等温线（二吸附等温线 1. 定定 义义 2. 应应 用用 3. 分分 类类1. 定定 义义指在一定温度下，某一组分在指在一定温度下，某一组分在固定固定相和流动相之间达到平衡时

7、，相和流动相之间达到平衡时，组分组分在固定相中的浓度在固定相中的浓度Cs对组分在对组分在流动流动相中的浓度相中的浓度Cm作图得到的曲作图得到的曲线，用线，用函数描述为函数描述为Cs=fCm）。）。2.特性特性等温线形状是重要色谱特性之等温线形状是重要色谱特性之一。一。反映一定温度下，吸附剂对溶反映一定温度下，吸附剂对溶液中某一组分的吸附能力。液中某一组分的吸附能力。描述组分在两相中浓度间的关描述组分在两相中浓度间的关系。系。对某一体系，组分的分布取决对某一体系，组分的分布取决于吸附等温线。于吸附等温线。3. 分分 类类 直线型直线型理想理想等温线类型等温线类型 凸型凸型多多数数 非线型非线型

8、凹型凹型低浓度时，每种等温线均呈线低浓度时，每种等温线均呈线型型高浓度时，等温线会发生弯曲，高浓度时，等温线会发生弯曲，呈凸型或凹型。呈凸型或凹型。 吸附等温线的形状和色谱特性图吸附等温线的形状和色谱特性图（1线型吸附等温线线型吸附等温线 定义：达到平衡时，组分在固定义：达到平衡时，组分在固定相中的浓度定相中的浓度Cs与其在流动相中与其在流动相中浓度浓度Cm成正比，直线斜率为成正比，直线斜率为KCs/Cm，其吸附等温线为线型。，其吸附等温线为线型。 特点：特点：a.组分移动速度依赖于组分移动速度依赖于K的大小，分离时移动速度不变，的大小，分离时移动速度不变，K越大移动速度越慢越大移动速度越慢

9、。b. 流出曲流出曲线呈对称形。线呈对称形。c.前不伸舌，后不前不伸舌，后不拖尾。拖尾。 （2凸型吸附等温线 定义： K值随组分浓度增加逐渐减小，其吸附等温线呈凸型。 特点：随着流动相中组分浓度增大相对吸附量缓慢减小，tR变小，色谱流出峰的极大值偏向谱带前沿，导致峰形拖尾。 原因之一：吸附剂表面活性中原因之一：吸附剂表面活性中心的不均一性。心的不均一性。 溶质在不同吸附点位上溶质在不同吸附点位上K不同。不同。溶质分子总是先占据吸附力强的溶质分子总是先占据吸附力强的点位点位K值大），再占据吸附力值大），再占据吸附力弱的点位弱的点位K值小），所以值小），所以K值值会在强吸附力点位被饱和后随着会在强

10、吸附力点位被饱和后随着溶质浓度的增加而逐渐减小，使溶质浓度的增加而逐渐减小，使吸附等温线呈凸型吸附等温线呈凸型 。 防止拖尾的方法：防止拖尾的方法： 在色谱分析中控制组分的量，使在色谱分析中控制组分的量，使其在一定的线性范围。其在一定的线性范围。 在流动相中加入水、醇等极性缓在流动相中加入水、醇等极性缓和剂，扩大吸附剂的线性范围。和剂，扩大吸附剂的线性范围。（ 降低吸附剂的活性，使吸附剂降低吸附剂的活性，使吸附剂表面活性中心趋于均匀。）表面活性中心趋于均匀。） 在吸附剂表面进行化学改性如在吸附剂表面进行化学改性如键合）键合） 。（3凹型吸附等温线凹型吸附等温线 定义：定义： K值随组分浓度增加

11、而逐值随组分浓度增加而逐渐增加，其吸附等温线呈凹型。渐增加，其吸附等温线呈凹型。 特点：溶质在低浓度时不易被吸特点：溶质在低浓度时不易被吸附，到一定浓度后吸附能力明显增附，到一定浓度后吸附能力明显增强，强，tR变大，色谱流出峰极大值偏变大，色谱流出峰极大值偏向谱带的后部，导致峰形伸舌。向谱带的后部，导致峰形伸舌。 二二. 吸附剂吸附剂1.对吸附剂的要求对吸附剂的要求2.常用吸附剂常用吸附剂3. 吸附剂的活性吸附剂的活性1.对吸附剂的要求对吸附剂的要求1要有一定的细度且粒度要要有一定的细度且粒度要均匀均匀2具有较大的吸附表面积和具有较大的吸附表面积和一定的吸附能力一定的吸附能力3与洗脱剂、样品不

12、起化学与洗脱剂、样品不起化学反应，且不溶于洗脱剂中反应，且不溶于洗脱剂中2. 常用吸附剂常用吸附剂 有机类：有机类： 活性炭、淀粉、蔗糖等、活性炭、淀粉、蔗糖等、 吸附剂吸附剂 聚酰胺、大孔树脂。聚酰胺、大孔树脂。 无机类：无机类： 氧化铝、硅胶、硫酸钙、氧化铝、硅胶、硫酸钙、 滑石粉、硅藻土等。滑石粉、硅藻土等。 1硅硅 胶胶SiO2xH2O)优点：适用于各类样品的分离优点：适用于各类样品的分离吸附能力：取决于骨架表面的硅吸附能力：取决于骨架表面的硅羟基羟基吸附机理：硅胶表面羟基作为质吸附机理：硅胶表面羟基作为质子给予体，通过氢键形式将溶质子给予体，通过氢键形式将溶质吸附在硅胶表面。吸附在硅

13、胶表面。硅胶具有弱酸性，可选择性地保硅胶具有弱酸性，可选择性地保留胺类和其它碱性化合物。留胺类和其它碱性化合物。活化温度：活化温度：1051102） 氧化铝氧化铝优点：分离能力强、活性可控优点：分离能力强、活性可控分类：酸性、中性、碱性，以中分类：酸性、中性、碱性，以中性氧化铝使用较多。性氧化铝使用较多。用处：分离生物碱、挥发油、萜用处：分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不稳定的苷类、醌、内酯等化合物。稳定的苷类、醌、内酯等化合物。活化温度：活化温度：2004003 3聚酰胺聚酰胺 常用：聚己内酰胺，常用：聚己内酰胺， 作用机理：形成氢键作用机理：形成

14、氢键（1 1酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧基形成氢键；酚类中的羟基或羧基形成氢键；（2 2酰胺基中的氨基与醌类、硝基类酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。作用。 4 4大孔吸附树脂大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔网状结一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。构的高分子吸附剂。 非极性和中等极性两类。非极性和中等极性两类。3 吸附剂硅胶、氧化铝的活性吸附剂硅胶、氧化铝的活性吸附剂的活性与含水量有一定的吸附剂的活性与含水量有一定的关系。关系。含水量愈高，其吸附活性愈低，含水

15、量愈高，其吸附活性愈低，活性级数愈大，吸附力就愈弱。活性级数愈大，吸附力就愈弱。含水量愈低，其吸附活性愈高，含水量愈低，其吸附活性愈高，活性级数愈小，吸附力就愈强。活性级数愈小，吸附力就愈强。所以吸附剂在用前须先经过活化所以吸附剂在用前须先经过活化处理。处理。 活化：在一定温度下，加热除活化：在一定温度下，加热除去水分以增强活性的过程。去水分以增强活性的过程。 失活：在一定温度下，加入一失活：在一定温度下，加入一定量水分使吸附剂活性降低的定量水分使吸附剂活性降低的过程称为失活。过程称为失活。硅胶含水量()活性级别氧化铝含水量()005315625103815三三. . 色谱条件的选择色谱条件的

16、选择在液在液- -固色谱中，除了正确选择吸固色谱中，除了正确选择吸附附剂外，还可以通过流动相的选择剂外，还可以通过流动相的选择来改变来改变K K值，或改变一对化合物的值，或改变一对化合物的K K值比，值比，从而从而使它们的使它们的K K值有最大的差别而达值有最大的差别而达到分离到分离. .流动相在色谱分析中除了起着溶流动相在色谱分析中除了起着溶质通过质通过色谱柱的作用，还影响着溶质的色谱柱的作用，还影响着溶质的分配系分配系数，所以在色谱分析中流动相的数，所以在色谱分析中流动相的选择也选择也很重要。很重要。 极性较大的化合物可以比较强的从溶液中被吸附剂吸附，需要极性较大的洗脱剂才能洗脱下来。常见

17、化合物按其极性由小到大常见化合物按其极性由小到大顺序为：顺序为：烷烃烯烃醚硝基化合物烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺类醇硫醇胺类酰胺类醇类酚类羧酸类。类酚类羧酸类。 常用溶剂的极性顺序为：常用溶剂的极性顺序为： 石油醚环己烷四氯化碳石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯烷乙醚氯仿乙酸乙酯丙酮正丁醇乙醇甲醇丙酮正丁醇乙醇甲醇水乙酸等。水乙酸等。选择色谱分离条件时，必须从选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相吸附剂、被分离物质、流动相三方面综合考虑。三方面综合考虑。 四四. 操作方法操作方法 1色谱柱的制备色

18、谱柱的制备 2加样与洗脱加样与洗脱 3检出检出第第2 2节节 分配柱色谱法分配柱色谱法基本原理基本原理载体载体固定相及其选择固定相及其选择流动相及其选择流动相及其选择操作方法操作方法优点优点吸附色谱主要适用于亲脂性物质吸附色谱主要适用于亲脂性物质的分离的分离, , 分配色谱即适用于亲脂分配色谱即适用于亲脂性物质的分离，亦适性物质的分离，亦适 用于亲水用于亲水性物质的分离性物质的分离有较好的重现性，可根据有较好的重现性，可根据K K值预值预示分离结果示分离结果分配等温线多为直线型，峰形对分配等温线多为直线型，峰形对称称流动相易于选择流动相易于选择 一一. . 基本原理基本原理一种基于不同组分在流

19、动相和一种基于不同组分在流动相和固定相之间分配系数的差异而固定相之间分配系数的差异而使之分离的色谱分析方法。使之分离的色谱分析方法。( (固定相：载体加固定液固定相：载体加固定液将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒将某种溶剂涂布在吸附剂颗粒表面或纸纤维上，形成一层液表面或纸纤维上，形成一层液膜，称为固定液，吸附剂颗粒膜，称为固定液，吸附剂颗粒或纸纤维称为支持剂或载体、或纸纤维称为支持剂或载体、担体。担体。) ) u亦有三种分配等温线，但以直线亦有三种分配等温线，但以直线型等温线最普遍。型等温线最普遍。u分配作用的描述采用溶剂极性分配作用的描述采用溶剂极性“类似类似 相溶相溶”u适用于各类型化合物，尤其是

20、极适用于各类型化合物，尤其是极性大的组分性大的组分mms sD DC CC C溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度K K 物理意义：当达到平衡时，溶质从物理意义：当达到平衡时，溶质从一种溶剂进入另一种溶剂的速度与一种溶剂进入另一种溶剂的速度与由另一种溶剂中出来的速度相等。由另一种溶剂中出来的速度相等。 分配等温线在较大浓度范围内呈分配等温线在较大浓度范围内呈线性，即分配色谱中以直线型分线性，即分配色谱中以直线型分配等温线最普遍，其洗脱峰峰形配等温线最普遍，其洗脱峰峰形对称而尖锐。对称而尖锐。 在分配色谱中，用溶剂极性来描在分配色谱中，用溶剂极性来描述

21、分配作用的。述分配作用的。 二二. .载体载体 在分配色谱法中载体只在分配色谱法中载体只起负载固定相的作用。起负载固定相的作用。1. 1.对载体的要求对载体的要求2.2.常用的载体常用的载体 1. 对载体的要求对载体的要求:化学惰性化学惰性对固定液有较强吸附性，但对对固定液有较强吸附性，但对组分无吸附性组分无吸附性颗粒大小均匀，纯真。颗粒大小均匀，纯真。（1硅胶：它可以吸收相当于本身硅胶：它可以吸收相当于本身重量的重量的50%以上的水仍不显湿状。以上的水仍不显湿状。（2硅藻土：是现在应用最多的载硅藻土：是现在应用最多的载体，由于硅藻土中氧化硅性质较为体，由于硅藻土中氧化硅性质较为致密，几乎不发

22、生吸附作用。致密，几乎不发生吸附作用。（3纤维素：是纸色谱的载体，也纤维素：是纸色谱的载体，也是分配柱色谱常用的载体。是分配柱色谱常用的载体。此外，还有淀粉，近几年来有采用此外，还有淀粉，近几年来有采用有机载体，如微孔聚乙烯粉等。有机载体，如微孔聚乙烯粉等。 1. 分配色谱法的分类分配色谱法的分类 2. 正相与反相的比较正相与反相的比较 3. 固定相及其选择固定相及其选择1. 分配色谱法的分类分配色谱法的分类正相分配色谱：正相分配色谱： 固定相的极性大于流动相。固定相的极性大于流动相。反相分配色谱：反相分配色谱： 固定相的极性小于流动相。固定相的极性小于流动相。正相色谱法与反相色谱法的比较 （

23、1在正相分配色谱法中，固定相在正相分配色谱法中，固定相有水、各种缓冲剂、稀硫酸、甲醇、有水、各种缓冲剂、稀硫酸、甲醇、甲酰胺、丙二醇等强极性溶剂及它甲酰胺、丙二醇等强极性溶剂及它们的混合液等。们的混合液等。（2在反相分配色谱中，常以硅油、在反相分配色谱中，常以硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂作液体石蜡等极性较小的有机溶剂作为固定液。为固定液。 正相色谱法常用的流动相：石油醚、正相色谱法常用的流动相：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯等或它们的混合物。等或它们的混合物。 反相色谱法常用的流动相则为正相色反相色谱法常用的流动相则为正相色谱法中的固定液如：水、各种

24、水溶谱法中的固定液如：水、各种水溶液包括酸、碱、盐及缓冲液）、液包括酸、碱、盐及缓冲液）、低级醇类等。低级醇类等。 1固定液的涂布与装柱固定液的涂布与装柱 2加样和洗脱加样和洗脱 3应用应用 u定义：定义：u 以离子交换剂为固定相，用水或与水混以离子交换剂为固定相，用水或与水混合的溶剂为流动相，根据离子交换剂对各合的溶剂为流动相，根据离子交换剂对各组分离子亲合力的不同而使其分离的方法组分离子亲合力的不同而使其分离的方法称为离子交换色谱法称为离子交换色谱法(ion exchange chromatography)。u目前应用最多的目前应用最多的-离子交换树脂离子交换树脂u包括基体离子和可交换离子

25、包括基体离子和可交换离子u分类：阳离子交换树脂，含分类：阳离子交换树脂，含-SO3H-COOHu 阴离子交换树脂，含阴离子交换树脂，含-NH2，NHRu规律：组分离子对基体离子的亲合力越大，规律：组分离子对基体离子的亲合力越大，即交换能力越强，就越易交换到离子交换即交换能力越强，就越易交换到离子交换剂上，保留时间就越长。剂上，保留时间就越长。u除去干扰离子除去干扰离子-如水的纯化如水的纯化u盐类的测定盐类的测定 ：H+R-+M+A- M+R-+H+A-交换下来的交换下来的H+用标准碱溶液滴定，用标准碱溶液滴定，如无机做过的如无机做过的Ksp(PbCl2)u痕量元素的富集：如牛奶中的含铜量测定痕

26、量元素的富集：如牛奶中的含铜量测定u 先用离子交换柱吸附铜离子，再用洗脱先用离子交换柱吸附铜离子，再用洗脱剂洗脱剂洗脱u定义：定义：u 利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的方法称而阻滞作用不同的差异而进行分离的方法称为分子排阻色谱法为分子排阻色谱法(gel chromatography)。u实质：分子筛效应实质：分子筛效应葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶LH-20聚苯乙烯凝胶聚苯乙烯凝胶亲水性凝胶亲水性凝胶亲脂性凝胶亲脂性凝胶u脱盐脱盐-蛋白质的脱盐蛋白质的脱盐u浓缩浓缩

27、 ：海水中浓缩少量的：海水中浓缩少量的VB12u去热源：去除注射剂中的热源去热源：去除注射剂中的热源u测定分子量及高聚物的分子量的分布情测定分子量及高聚物的分子量的分布情况：先作校正曲线况：先作校正曲线VR=K1-K2LogM 一、基本原理一、基本原理二、固定相二、固定相三、展开剂三、展开剂四、操作方法四、操作方法五、定性分析五、定性分析六、定量分析六、定量分析 1.基本原理基本原理1薄层色谱法薄层色谱法2比移值比移值Rf3相对比移值相对比移值(Rst) 4薄层色谱法的特点薄层色谱法的特点 1薄层色谱法薄层色谱法 将吸附剂或载体均匀地铺在将吸附剂或载体均匀地铺在玻璃板或塑料板、铝箔、聚酯薄玻璃

28、板或塑料板、铝箔、聚酯薄膜上，形成薄层，把要分离的样膜上，形成薄层，把要分离的样品点加在薄层上，然后用合适的品点加在薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。量的目的。2比移值Rf 在薄层色谱法中，常用比移值Rf来表示各组分在色谱中的保留行为。c ca a原原点点至至溶溶剂剂前前沿沿的的距距离离原原点点至至斑斑点点中中心心的的距距离离R Rf f 在给定条件下，在给定条件下，Rf值为常数，其值值为常数，其值在在01之间。之间。 Rf为为0，表示化合物在薄层上不随，表示化合物在薄层上不随溶剂扩散而移动，仍在原点位置；溶剂扩散而移动，仍在原点位置； Rf

29、为为1，表示溶质不进入固定相，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶剂同步移动。即表示溶质和溶剂同步移动。 一般要求一般要求Rf值在值在0.2 0.8之间，之间， 最佳范围是最佳范围是0.30.5。 解决方法：解决方法： 由于由于Rf值重现性差，进行定性值重现性差，进行定性困难的问题，可以采用相对比困难的问题，可以采用相对比移植移植Rst来定性。来定性。 3相对比移值相对比移值(Rst) ：是指试样中某：是指试样中某组分的移动距离与参照物移动距离之组分的移动距离与参照物移动距离之比。比。 参照物可以是另外加入的某一物质的参照物可以是另外加入的某一物质的纯品，也可以是试样混合物中的某一纯品，也可以

30、是试样混合物中的某一组分。组分。 Rf 与与Rst的取值范围不同，的取值范围不同， Rf值小于值小于1，而，而Rst值不一定小于值不一定小于l。的的距距离离原原点点到到参参照照物物斑斑点点中中心心心心的的距距离离原原点点到到样样品品组组分分斑斑点点中中stR4薄层色谱法的特点薄层色谱法的特点展开时间短，十几到几十分钟；展开时间短，十几到几十分钟；分离能力强，斑点集中；分离能力强，斑点集中；灵敏度高，用量几至几十微克；灵敏度高，用量几至几十微克；显色方便；显色方便；仪器简单，操作方便。仪器简单，操作方便。 200300目目 1.硅胶硅胶 硅胶硅胶H 硅胶硅胶HF254nm 硅胶硅胶G 硅胶硅胶G

31、F254 硅胶硅胶HF254+366nm 2.氧化铝氧化铝 氧化铝氧化铝H 氧化铝氧化铝G 氧化铝氧化铝HF254 选择原则同柱色谱选择原则同柱色谱 选择方法：图解法、点滴实验法选择方法：图解法、点滴实验法 规律：规律：对酸性组分，加入一定比例的酸，对酸性组分，加入一定比例的酸，可防止斑点拖尾现象。可防止斑点拖尾现象。 在分离碱性物质如某些生物碱时，在分离碱性物质如某些生物碱时，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展开剂为宜；某些碱性较弱的则选用碱性展开剂为宜；某些碱性较弱的生

32、物碱可使用中性展开剂。生物碱可使用中性展开剂。 四四. 操作技术操作技术操作步骤：操作步骤：选选 择择制制 板板点点 样样展展 开开检视检视定性定量定性定量 选选 择择 (1)(1)选选 板板 玻璃板玻璃板 表面光滑、平整清洁表面光滑、平整清洁 (2)(2)固定相吸附剂）固定相吸附剂） 粘合剂：粘合剂：CMC-NaCMC-Na、煅石膏、煅石膏、淀粉等淀粉等 (3)(3)流动相流动相( (展开剂展开剂) ) (4)(4)显色剂显色剂 制制 板板 薄层板的制备，就是将吸薄层板的制备，就是将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板附剂均匀地涂铺在玻璃板上，使成薄层称之为制板。上，使成薄层称之为制板。 制板的步骤：制

33、板的步骤： (1)吸附剂的涂布吸附剂的涂布 (2)板的活化板的活化(1) 吸附剂的涂布吸附剂的涂布 硬板硬板(加粘合剂加粘合剂) 硅胶硅胶 薄板薄板 软板软板(不加粘合剂不加粘合剂) 氧氧化铝化铝硬板的涂铺方法有以下几种：硬板的涂铺方法有以下几种：倾注法倾注法 、平铺法、涂铺器、平铺法、涂铺器 、喷、喷雾法雾法硬板的涂铺装置示意图硬板的涂铺装置示意图具有薄层厚度调节器的滑行具有薄层厚度调节器的滑行玻璃板涂布器玻璃板涂布器Kirchner型）型）Stahl薄层涂布示意图(2)板的活化板的活化铺成的薄层，置于水平台面上铺成的薄层，置于水平台面上晾干也可以热风吹干），晾干也可以热风吹干），再置烘箱中

34、于再置烘箱中于105110活活化化0.5小时活化小时活化1小时，即可。小时，即可。点点 样样 薄层分析时，一般使用微薄层分析时，一般使用微量注射器或毛细管点样。量注射器或毛细管点样。 点样注意事项：点样注意事项： （1溶剂应易挥发，不要以水溶剂应易挥发，不要以水为溶剂，否则会改变吸附剂的活为溶剂，否则会改变吸附剂的活度。度。 （2样品浓度不能过高，否则样品浓度不能过高，否则会产生拖尾现象；浓度也不能过会产生拖尾现象；浓度也不能过低，否则起始点会为空心点，导低，否则起始点会为空心点，导致色谱斑点畸形。一般对照品浓致色谱斑点畸形。一般对照品浓度易控制在几个毫克每毫升。度易控制在几个毫克每毫升。（3

35、点样体积宜在点样体积宜在20l以下，直以下，直径以径以3mm为宜，并需分次点加，为宜，并需分次点加，以免使原点扩散，直径太大。以免使原点扩散，直径太大。（4点加量一般为几点加量一般为几几十微克，几十微克，过多则斑点太大，形状不良而使过多则斑点太大，形状不良而使分离不好或拖尾；点样量太少则分离不好或拖尾；点样量太少则使斑点模糊或显不出色。使斑点模糊或显不出色。（5原点距离底边、两侧边及点原点距离底边、两侧边及点与点之间的距离均应大于与点之间的距离均应大于1.5cm。（6在进行薄层定量时，要求原在进行薄层定量时，要求原点直径一致，点样间距精确。这点直径一致，点样间距精确。这是保证定量精确度的关键。

36、并且是保证定量精确度的关键。并且所有原点应在同一水平线上，斑所有原点应在同一水平线上，斑点面积也尽可能一致。点面积也尽可能一致。（ 7 ）点样时最好在密闭容器中）点样时最好在密闭容器中或比较干燥的条件下完成，避免或比较干燥的条件下完成，避免薄板吸收水分降低活性，若在空薄板吸收水分降低活性，若在空气中点样，时间最好在气中点样，时间最好在10分钟内分钟内完成。点样完毕后使斑点干燥，完成。点样完毕后使斑点干燥，再选用适当溶剂展开。再选用适当溶剂展开。 展展 开开（1展开原理展开原理（2展开箱的分类展开箱的分类（3展开方式展开方式（4展开剂的选择展开剂的选择（5边缘效应边缘效应（1展开原理展开原理将薄

37、板一端浸入展开剂，点样将薄板一端浸入展开剂，点样处不可接触展开剂，展开剂处不可接触展开剂，展开剂借助毛细作用上升，带动样借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。品中组分的迁移。（3展开方式展开方式l软板只能进行近软板只能进行近水平展开水平展开l硬板可以进行近硬板可以进行近水平、下行、上水平、下行、上行、径向、双向、行、径向、双向、多次展开，其中多次展开，其中以上行法展开最以上行法展开最为常用。为常用。（4展开剂的选择展开剂的选择首选单元溶剂，再选混合溶剂首选单元溶剂，再选混合溶剂由简至繁）由简至繁） 若二元溶剂系统还不够理想，若二元溶剂系统还不够理想，可考虑多元溶剂系统。可考虑多元溶剂系统。（

38、5边缘效应边缘效应 定义：点于同一薄层的同一定义：点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开过物质的斑点，在色谱展开过程中，靠薄层边缘处斑点的程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的值与中心区域斑点的Rf值值有所不同的现象，称为边缘有所不同的现象，称为边缘效应。效应。产生原因：在极性强弱不等产生原因：在极性强弱不等的混合溶剂展开系统中，展的混合溶剂展开系统中，展开剂挥发速率不同。开剂挥发速率不同。减少边缘效应的办法：减少边缘效应的办法：用较小体积的展开缸或将薄层在缸用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间，待溶剂蒸汽达到内放置一定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再展开；饱和后再展开；在展开缸

39、内壁贴上浸湿展开剂的滤在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条，效果也很好；纸条，效果也很好；采用采用3cm以下的狭小薄板，只点以下的狭小薄板，只点23个点时，也会减小边缘效应。个点时，也会减小边缘效应。 检视检视 （1物理检出法光学）物理检出法光学） （2化学检出法显色）化学检出法显色）（1 1物理检出法物理检出法日光检出日光检出254nm254nm或或365nm365nm光下看荧光斑点光下看荧光斑点荧光薄层展开，紫外灯下看暗斑荧光薄层展开，紫外灯下看暗斑优点：方便，不改变化合物的性质。优点：方便，不改变化合物的性质。注意：对光敏感的化合物要避光，注意：对光敏感的化合物要避光，并尽量缩短用紫外光照

40、射的时间。并尽量缩短用紫外光照射的时间。 （2化学检出法化学检出法显色剂种类：显色剂种类： 专属型显色剂专属型显色剂 通用型显色剂通用型显色剂五、定性分析五、定性分析（1用保留值定性用保留值定性Rf（2用多种溶剂系统定性用多种溶剂系统定性 （1斑点捕集后洗脱测定法斑点捕集后洗脱测定法（2薄层扫描法薄层扫描法七七.高效薄层色谱高效薄层色谱 在经典薄层色谱法基础上发在经典薄层色谱法基础上发展起来的更灵敏、精细的薄展起来的更灵敏、精细的薄层技术。层技术。吸附剂颗粒小而均匀，用喷雾吸附剂颗粒小而均匀，用喷雾法制备的薄层很均匀，分离法制备的薄层很均匀，分离效率比经典薄层色谱提高三效率比经典薄层色谱提高三倍。分离组分多，分析时间倍。分离组分多，分析时间短。短。第六章第六章 纸色谱法纸色谱法一定义一定义以纸作为载体，以滤纸纤维上以纸作为载体，以滤纸纤维上吸附的水