Y染色体微缺失检测指导

1、Y 染色体微缺失是严重少精子或无精子症的重要原因，是导致男性不育的第二大遗传因素，其发生率仅次于Klinefelter 综合征 (克氏综合征) 。从 1999 年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网(EAA/EMQN为提高诊断质量，出版了 Y染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的实验质量评价方法。最新版的实验室指南是2013年9月EAA/EMQNS据12年的临床积累和专家共识，在 1999版和2004 版的基础上修订而成。新指南重点阐明：在少精子症或无精子症男性中发现的 Y 染色体微缺失区域，主要是无精子因子(azoospermia factor , AZF)区域仅包含AZFaAZF

2、b AZFbc、AZFc和AZFabc区，独立的 AZFd区并不存在；AZFc区中gr/gr 缺失 是影响精子生成的一个危险因素，但临床意义尚存争议，不作为常规检查指标；检测位点增加并不能提高检测灵敏度，反而可能使结果复杂化；基于两管多重PCR勺检测方法仍适用于整个 AZF缺失检测。EAA/EMQN2年国际质量评估计划(EQA计划) 的实施表明，参与实验室通过规范实验操作，改善报告质量，可有效降低诊断错误率。 Y 染色体微缺失在中国不育男性中的发生频率为%，处于较高水平，我们建议将AZF 检测作为男性严重少精子或无精子症的常规检测项目，呼吁国内 AZF 检测实验 室加入 EQA 计划 ， 完善

3、中 国 Y 染色体微 缺失检测实验操作规范 。Y 染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF 缺失模式、检测序列标签位点(sequence - tagged site, STS) 的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立Y染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。EAA/EMQNI新的2013 版指南对以上问题都给出了明确的专家共识， 对我国建立自己的检测指南有重 要的指导意义。1、 Y 染色体微缺失发生频率Y 染色体微缺失在健康人群中发生率约为 1/4 000 ，但在不育男性中显着升高，微缺失发生频

4、率为 工% 10%（1至更高）。2013版指南指出Y染色体微缺失在中国不育男性中发生频率为 %， 处于较高水平。 2006 年朱晓斌等1 针对中国不育男性染色体的研究表明 AZF 微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为%，严重少精子症患者中发生率为%，与国内外其他学者的研究基本一致。随着微缺失分子机制的阐明和Y染色体男性特异区域的结构（MSY）W序完成，结合十多年临床数据分析，EAA专家总2沿用Repping等2对Y染色体微缺失区域的定义模式，分为：AZFa区缺失、AZFb区缺失、AZFbc区缺失和 AZFc区缺失，认为只有该微缺失模式有明确的临床表现。国内外学者对 AZFd 区缺失是否存在

5、一直存有争议。尽管发现在AZFb与AZFc两区域之间存在新的缺失位点（一些学者认为的AZFd 区缺失 ） ，但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。所以第四区域AZFd区缺失仍存在较多争议。Musl tmanolu等3在2005年的一项研究中指出AZFd缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。2013年，陈科等 4 在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的AZFd 区缺失。然而，至今为止 AZFd 区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还需进一步确认。2、 gr/gr 缺失不纳入常规检查项目研究证实 gr/gr 缺失属于 AZFc 部分缺失

6、，是影响精子生成的一个重要因素，但是否需要将其作为常规检查指标尚存争议。尽管gr/gr 缺失可导致AZFc 区一半以上基因丢失，但其临床意义仍不明确，因为该缺失患者精子生成表型变化多样，从少精到精子数目正常都存在。gr/gr 缺失表型在不同人种和地域间存在差异，已有研究证实在欧洲白种人（ 除了法国人5 和德国人 6） 和西太平洋居民中， gr/gr 缺失是男性生精障碍的高危因素7 。但在部分亚洲国家如日本和中国 8,9 ， gr/gr 缺失在健康人群中的概率和在不育患者的概率无显着差别。李铮等10 研究发现Y 染色体 gr/gr 缺失既存在于严重不育男性，也存在于生精功能正常的捐精者中，缺失可

7、能遗传自父亲，并未影响精子的发生，不能认为是精子发生的遗传风险因子。因此在中国 gr/gr 缺失不建议作为Y 染色体微缺失常规检测的缺失模式。三、AZF缺失基因型/表型相关性Y 染色体微缺失主要是AZF 的缺失，该区域包含精子生成的相关基因家族，不同程度的缺失可导致少精子或无精子症。 AZF 区进一步可分为AZFa、 AZFb、 AZFc 区域。AZFa区域缺失通常导致唯支持细胞综合征（SCO综合征）和无精子症。如果诊断为整个AZFa区域缺失，从睾丸中获得精子的概率为0。AZFb和AZFbc（P5/P1近端；P5/P1远端，P4/P1远端）缺失的典型睾丸组织学特征是SCO宗合征或精子发生阻滞导

8、致的无精子症。研究表明这些缺失与整个AZFa 区域缺失情况一样，患者也不能通过睾丸穿刺（TESE）获得精子。严重少精子或无精子症患者中AZFc缺失发生频率最高，AZFc 缺失的临床表型和睾丸组织学类型多种多样。一般说来， AZFc 缺失患者尚残存精子生成能力。罕见情况下，其缺失在自然状态下可遗传给其男性后代11 。近50%AZF缺失的无精子症患者可通过TES或得精子，进行单精子卵胞浆内注射（ICSI）受孕，但这些患者的男性后代都将是AZFc缺失的携带者。4、 Y 染色体微缺失检测人群Y 染色体微缺失检测不仅可以明确严重少精子或无精子症的病因，而且可以对预后做出一定的评估。Y染色体微缺失通常见于

9、无精子症或精子浓度少于2X 106/ml的患者。一般的临床参数，如激素水平、睾丸大小、精索静脉曲张、睾丸畸形、感染等对是否存在Y 染色体微缺失没有任何预测价值， Y 染色体微缺失必须通过分子检测来确定。拟行ICSI 的严重少精子症应该做Y 染色体微缺失检测，而对非梗阻性无精子症患者在行 TESE或者睾丸显微切开取精术前也应该进行常规检测，因为当整个AZFa整个AZFb AZFbc或者AZFabc缺失时都不建议给患者做手术。需要特别提醒的是，如果采用辅助生育技术，AZFc缺失可以垂直遗传给男性后代。如果患者通过AZF检测发现部分AZFa AZFb或AZFc缺失，建议家族中其他男性也 进彳f AZ

10、F检测，因为这种缺失是可以遗传的。但整个AZFa AZFb AZFbc或者AZFabc缺失时不建议家族其他男性成员做AZF检测，因为这些缺失通常没有精子生成。对丈夫携带AZFc区缺失类型的夫妻，研究其ICSI受孕情况12,大部分研究表明Y 染色体微缺失存在与否不影响受精率和受孕率，但也有个别报道指出微缺失会导致受精率下降，影响胚胎质量，降低囊胚率和ICSI 成功率 13 。5、 STSY染色体微缺失上的 STS位点高达131个，如果用于Y染色体微缺失检测的 STS过 少，将有可能漏检某些区域的缺失，但若采用的STS过多，则可能包含一些多态性序列，而这些位点在正常可育男性中也可出现缺失。指南指出

11、，原则上只要对每个 AZF区域一个非多态性的STS位点进行分析就足以判 断AZFa AZFb> AZFc是否存在缺失。任何一个已知缺失区域都包括多个 STS位点， 每个区域设置2个STS位点有助于增加检测的准确性。鉴于众多实验室经验总结和外部质量控制，并考虑到多重 PCRT增的形式，在1999和2004版指南中推荐的经典 STS 引物仍然有效，这些引物包括： AZFa: sY84 、 sY86； AZFb： sY127、 sY134；AZFc: sY254、sY255 （都在DAZ基因上）。这些STS位点引物由多个实验室和外部质量控制实验证明：结果可信重复性好。采用这些引物几乎能够检测到

12、所有临床上的相关缺失和文献报道的 3 个 AZF 区域95%以上的缺失，设计的这套引物能完全满足常规检测。它是一个简单的标准，便于实验室质量控制和缩小实验室之间的检测差异，因此强烈推荐所有实验室都采用这些引物。指南指出一些检测方法和试剂可检测很多STS位点，但并不能提高检测的灵敏度，反而可能使结果复杂化、难以解释，因为这可能检测到很多假的缺失位点，尤其是当DNAW量不好，PCR件不是最佳时。而大部分试剂盒并没有额外的单重PCRE确认可疑结果，因此指南并不推荐增加STS位点14 o六、PCR勺形式和内部质量控制Y染色体微缺失检测采用多重 PCR#系，体系中设置的 PCRSI物应i包括2个内对 照

13、：sY14（SRY）、ZFX/ZFY; 6 个 STS位点：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255。PCR»设立内对照（SRY、ZFX/ZFY基因），阳性对照（健康的男性DNA）,阴性对照（女 性DNA和水空白对照（用水代替模板，即含有除模板 DNA外所有成分的PC皈应）。阳性对照监测实验操作是否有效，阴性对照监测DN幅否污染，空白对照监测试剂是否污染。内对照 SRY基因是男性性别决定基因，位于Y染色体短臂，内对照 SRY基因可以在ZFY基因丢失时证明 Y染色体特征序列的存在（比如：在XX男性中）。 ZFX基因检测不仅可以作为女性 DNA寸照，也可作为没有

14、SRYS因的46, XX男性患 者唯一的阳性对照。指南推荐的相关操作都经过认真设计和优化，采用两管多重PC皈应，每管多重PCR反应体系中都包括每个区域的一个位点。当标本出现整个AZFa AZFb或AZFc区缺失时，两管PCRK应中相应区域设置的 2个STS位点产物都会缺失。当AZFa和AZFb 区域出现部分缺失时，相关区域单个位点的缺失是有可能的，但需小心求证，对整个区域进行详细的研究，目前这种情况很少见，被认为是例外。通常认为 AZFc 区 的 sY254 或 sY255 单个缺失是实验结果错误。7、 Y 染色体微缺失检测方法EAA/EMQN!荐采用多重PC昉法中&测Y染色体微缺失。

15、基于多重PCR勺Y染色体微 缺失检测方法很多，如实时荧光PCR(Real - time PCR)、电泳法和芯片法等。Real-time PCR佥测采用荧光标记探针，不涉及电泳，检测速度更快，数字化结果更加 直观，因此指南推荐有条件的实验室都应采用该方法。在没有 Real - time PCR检 测仪的实验室，可采用电泳法或毛细电泳法。其他的检测方法如基因芯片检测，其 花费昂贵，且包含太多不必要的位点，不为指南所推荐。实验室建立一种新的检测方法，都需经过大量样本验证，并明确指出所采用的方法，而不是简单的描述 " 根 据指南方法"。指南推荐方法特指两管多重 PCR方法，检测位点如上文所述 6个经 典位点。8、 EAA/EMQN 12年实验总结进彳f AZF