急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究

1、急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究         11-03-25 11:45:00     编辑：studa20                作者：姚晨, 方娟娟, 高丽丽, 丁家华, 束国防, 余卫平【摘要】  目的：研究急性髓性白血病病人外周血中肿瘤抑制基因RIZ1的表达

2、状况和该基因启动子区甲基化状态及两者之间的关系。方法：以37例初发急性髓性白血病病人和15例正常人外周血标本为研究对象。RTPCR检测RIZ1 mRNA水平,甲基化特异性PCR(MSP)检测RIZ1基因启动子区甲基化状态。结果:急性髓性白血病病人标本与正常人标本比较,RIZ1基因的表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。急性髓性白血病标本中RIZ1基因启动子区甲基化率为29.7%(11/37)。存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本中,RIZ1基因表达缺失或降低。结论：RIZ1基因表达下降与急性髓性白血病的发生有关, 其部分机制在于基因启动子区甲基化。 【关键词】  急

3、性髓性白血病; RIZ1基因; DNA甲基化Abstract Objective: To investigate the expression of RIZ1 gene in acute myeloid leukemia and to analyze the relationship between this alteration and the promoter hypermethylation of RIZ1 gene. Methods: The expression of RIZ1 mRNA in peripheral blood from 37 patients of primary

4、acute myeloid leukemia samples and in peripheral blood from 15 normal persons samples was detected by reverse transcripitionpolymerase chain reaction(RTPCR). Methylationspecific PCR(MSP)was used to assay the methylation of RIZ1 gene promotor region. Results: Compared with normal person, the RIZ1 gen

5、e expression level decreased significantly in acute myeloid leukemia(P<0.05). The Methylation rate was 29.7%(11/37) in acute myeloid leukemia. The expression of RIZ1 mRNA was found to be lower in the acute myeloid leukemia samples with RIZ1 promoter methylation. Conclusion: Downregulation of RIZ1

6、 gene expression plays an important role in the development of acute myeloid leukemia, and this alteration is partially caused by RIZ1 gene promoter methylation.Key words acute myeloid leukemia; RIZ1gene; DNA methylationRIZ1是定位于1p36的一个肿瘤抑制基因, 属于核蛋白甲基转移酶超家族成员。RIZ1失活在多数肿瘤中常见, RIZ1 mRNA表达下降或缺失常与RIZ1启动子

7、区甲基化有关。研究已经发现,肿瘤抑制基因RIZ1 mRNA表达缺乏既见于急性髓性白血病细胞株AML193又见于慢性髓性白血病细胞株K562,提示该现象属于髓性白血病的分子改变之一。采用转基因方法证实RIZ1具有髓性白血病细胞凋亡诱导作用1。本研究收集急性髓性白血病病人外周血标本,对RIZ1 mRNA及其甲基化状态进行检测,旨在探讨急性髓性白血病病人RIZ1基因的表达状况及其甲基化状态。1 材料与方法1.1 标本的来源37例急性髓性白血病病人外周血标本取自东南大学附属中大医院血液科发病初期的病人,其中男21例,女16例,中位年龄44岁。按FAB标准分型：M15例,M211例,M38例,M510例

8、,M63例。15例健康志愿者的外周血标本作为正常对照,中位年龄38岁。1.2 方法1.2.1 RIZ1 mRNA的检测 (1) 单个核细胞分离与裂解：取肝素抗凝血510 ml, 生理盐水缓冲液稀释后,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,经生理盐水洗涤后Trizol裂解,-80 保存。(2) 提取总RNA：采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)并按其说明操作。通过紫外分光光度计(HITACH U2001)测RNA纯度和浓度。取OD260 nm/OD280 nm值在1.82.0范围内的产物进行逆转录。(3) cDNA的合成：按TaKaRa RTPCR试剂盒说明书

9、操作,取2.0 g总RNA进行逆转录反应。反应体系为20 l,包含10×RT buffer 2.0 l,2.5 mmol·L-1 MgCl2 4.0 l,10 mmol·L-1 dNTP 2.0 l,Olid(dT)1.0 l,RNase inhibitor 0.5 l,AMV 1.0 l,无RNase水补足反应体系。反应条件为：30 10 min,42 20 min,99 5 min,4 5 min。获得产物置-20 保存。(4) RIZ1基因的扩增：以获得的cDNA为模板通过PCR仪(Eppendoff公司)扩增该基因。RIZ1基因引物由上海英骏生物技术有限公

10、司设计及合成。上游序列为5GAAGT GAGGCTTTTCCCTTCT3, 下游序列为5CTCAGGGTTGTCTTCCCCA3,扩增的片段长度为357 bp。以actin为内参,上游序列为5GCAAGAGAGGCATCCTCACC3,下游序列为5GCACAGCCTGGATAGCAACG3,扩增的片段长度为240 bp。以pRIZ1 RH质粒(由加拿大Saskatchewan大学癌症研究中心提供)为模板作为阳性对照,灭菌去离子水为阴性对照。反应体系为50 l,包含5×PCR buffer 10 l,20 pmol·L-1上、下游引物各0.5 l,cDNA 10 l,Taq

11、DNA聚合酶1 l,灭菌去离子水补足体系。反应条件为：95 5 min,95 30 s,退火温度RIZ1 53 /actin 65 30 s,72 1 min,共40个循环;72 延伸10 min。产物电泳应用FR200紫外可见分析装置(上海复日科技有限公司)和smart view TM 2001生物电泳图像分析软件对电泳条带进行分析。RIZ1 mRNA相对含量=RIZ1条带密度/actin条带密度。1.2.2 RIZ1基因甲基化的分析 应用DNA提取试剂盒(北京天根公司)及甲基化修饰试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)并按其说明书操作,提取所有标本中单个核细胞DNA并加以甲基化修饰。采用甲基化

12、特异性PCR(methylationspecific PCR, MSP)法,使用非甲基化与甲基化两对引物检测标本中RIZ1基因的甲基化状态。引物设计参照文献2报道,由上海英骏生物技术有限公司合成。非甲基化引物的上游序列为5TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3,下游序列为5ACTATTTCACCAACCCCAAGA3;甲基化引物上游序列为5GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3, 下游序列为5GCTATTTCGCCGACCCCGACG3;扩增的片段长度分别为175 bp和177 bp。PCR反应条件：95 10 min,94 30 s,退火温度56 (非甲基化)/68 (甲基化)

13、45 s,72 1 min,共40个循环;最后72 延伸10 min。获得产物电泳、摄像,并随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各1例进行测序分析。1.3 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件,均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 RIZ1基因mRNA表达状况RTPCR检测结果表明,37例急性髓性白血病病人和15例正常对照者外周血标本中,RIZ1 mRNA相对含量的平均值分别为0.50±0.20与0.79±0.12,急性髓性白血病病人外周血中RIZ1 mRNA表达低于正常对照者,差异有显著性(P<0.05)。其中15例急性髓性白血

14、病病人外周血标本RIZ1 mRNA表达降低或缺失(图1)。M. 100 bp DNA相对分子质量Marker; 1. 正常人标本; 2. 阴性对照; 36. 急性髓性白血病病人标本; 7. 阳性对照图1 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中RIZ1 mRNA表达状况Fig 1 Expression of RIZ1 mRNA in acute myeloid leukemia and normal samples2.2 RIZ1启动子区甲基化状态MSP法分析表明,37例急性髓性白血病病人外周血标本中11例存在RIZ1启动子区甲基化,甲基化率为29.7%(11/37)。15例正常人外周血标本均为

15、非甲基化。图2显示部分标本检测结果,在急性髓性白血病标本中,3、4、12和21号标本扩增出175 bp的U片断和177 bp的M片断,说明存在RIZ1启动子区甲基化;而9和15号标本仅扩增出175 bp的U片断,说明RIZ1启动子区未甲基化;8号正常标本只扩增出175 bp的U片断,也说明RIZ1启动子区未甲基化。Marker. DNA相对分子质量标记; M. 甲基化条带(177 bp); U. 未甲基化条带(175 bp); 1、2、3、5、6、7. 3、4、9、15、12和21号病人标本; 4. 8号正常标本图2 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中RIZ1基因甲基化状态Fig 2 Me

16、thylation status of RIZ1 gene in acute myeloid leukemic and normal samples2.3 MSP产物测序分析随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各1例进行测序,结果与GenBank中RIZ1基因启动子区的序列作对比,可见未甲基化产物中的胞嘧啶全部替换为胸腺嘧啶,未甲基化序列中的C经修饰则转变为T;而甲基化产物所有CpG对应的胞嘧啶均保持不变,CpG以外的胞嘧啶则替换为胸腺嘧啶,从而证实受检MSP产物是RIZ1基因启动子区的部分序列,甲基化序列中CpG的C未被硫化,仍为C。换言之,MSP产物测序结果中,存在CpG表明CpG甲基化,存在

17、TpG表明CpG未甲基化(图3)。因此,该测序结果表明本研究中MSP法分析可靠。N(GenBank:AF472587.1 61-961)TCCG AC TG G AGTC A A GA TGG CGG CGG CG CGGA. 4号未甲基化样本测序结果N(GenBank:AF472587.1 61-961)TCCG ACTGG AGTC A AGA TG G CGG CGG CG CGGB. 12号甲基化样本测序结果图3 RIZ1基因启动子区未甲基化与甲基化样本的测序结果Fig 3 Sequencing results of RIZ1 gene promoter unmethylation and methylation samples2.4 RIZ1启动子区甲基化状态与基因表达的相关性在RIZ1表达降低或缺失的15例急性髓性白血病病人外周血标本中,