抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用(1)

1、抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用(1)】目的： 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶，探讨其对靶RNA的切割作用.方法： 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123)，构建其自剪切转录载体，观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果： 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中，顺式核酶发生了自身剪切，并释放出正确的目的核酶，多位点核酶可切割靶RNA，且效率高于单一核酶，其切割效率分别为 (3710)% (Rz1), (518)% (Rz2 ), (6815)% (Rz3) 和(8811)% (Rz123

2、).结论： 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA，具有较高的生物活性.【关键词】 内皮，血管；内皮生长因子；RNA，催化；切割；体外研究0引言肿瘤的生长、转移依赖于肿瘤血管的生成.肿瘤细胞不仅通过血管从宿主获得营养和排出代谢产物，而且通过肿瘤血管向宿主输入大量肿瘤细胞，导致肿瘤的不断生长和转移.血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有促血管形成、增高血管通透性和促进内皮细胞有丝分裂等多种功能，在肿瘤的生长转移中起关键性的作用.抑制和阻断VEGF的表达，可以显著抑制多种肿瘤的生长和转移.抗血管生成治疗肿瘤具有高效低毒和不

3、易产生耐药性等特点，已成为当今肿瘤研究的热点1-3.核酶（ribozyme, Rz）是能够序列特异性切割靶RNA的一类RNA分子，通过人工设计合成的特异性核酶分子即可阻断有害基因的表达.锤头状核酶分子较小、结构简单、人工设计容易，且在靶RNA中出现率高，因而被广泛用于基因治疗的研究4.本研究选择VEGF165 基因mRNA为靶分子，设计合成多位点锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体，观察多位点核酶对VEGF165 mRNA的切割作用.1材料和方法11计算机设计核酶采用中科院上海生化研究所陈农安研究员编制的核酶设计软件程序，确定VEGF165 mRNA上的核酶切点位置，根据Symons的锤头状核

4、酶结构模型，设计核酶的切割活性中心及其两侧的结合序列5，并采用加拿大国家科学院Zuker编写的pcFOLD软件对靶mRNA切点两翼碱基序列二级结构进行分析预测，确定核酶的序列和切点位置.12质粒、菌种及试剂质粒pGEMRzHBV（含有5和3顺式自剪切核酶）及宿主菌JM109由第四军医大学唐都医院感染病科李谨革博士惠赠.pGEM3Zf（ ）VEGF质粒（含VEGF165基因全序列）由美国哥伦比亚大学Abraham JA教授惠赠.IPTG、Xgal和限制性内切酶购自华美公司，T4DNA连接酶和T7RNA聚合酶为Promega公司产品，质粒纯化试剂盒和转录试剂盒为Gibco公司产品， 32PUTP购

5、自北京亚辉公司.13合成核酶3个核酶基因均由大连宝生物技术有限公司合成.合成的核酶经T4多核苷酸激酶磷酸化、变性、退火，分别形成粘性末端（XbaI, Hind），（Hind, BamH）和（BamH, Aat）.14设计构建核酶自剪切转录载体合成的3个核酶片段经T4连接酶连接，得到带有Xba和Aat黏性末端的片段.质粒pGEMRzHBV的T7启动子下游依次排列有5 顺式核酶、RzHBV和3 顺式核酶.经Xba和Aat双酶切及10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，用质粒纯化试剂盒回收.用T4DNA连接酶与上述核酶连接片段连接，构成核酶自剪切转录质粒pGEMRz123（Fig 1）.将其转化感受态JM10

6、9菌，经蓝白筛选阳性克隆菌落，抽提质粒，进行酶切分析和DNA测序鉴定.图1pGEMRzVEGF质粒的构建略15核酶体外转录及对靶mRNA的切割核酶Rz123分别经（Xba, Hind），（Hind,BamH）和（BamH, Aat）双酶切得到Rz1，Rz2和Rz3.重组质粒pGEMRz123和pGEM3Zf（ ）VEGF经内切酶酶切线性化后，用T7体外转录试剂盒合成Rz123，Rz1，Rz2，Rz3和底物VEGF165 mRNA.将Rz123，Rz1，Rz2，Rz3和底物RNA按101比例混合，切割反应体系为pH 76的75 mmol/L TrisHCl和6 mmol/L MgCl2，反应体积

7、为10 L反应2 h后用终止液7 mmol/L Urea和20 mmol/L EDTA终止反应， 60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影确定切割条带位置，激光图像分析仪分析切割效率.以上每个反应重复6次.统计学处理： 统计分析采用SPSS软件进行方差分析，两两之间采用最小显著差法.2结果21核酶的计算机设计根据计算机对其二级结构的分析，发现VEGF165 mRNA上108，189和249 3个位点的二级结构较为理想，分别将切割这3个点的核酶命名为Rz1，Rz2，Rz3.根据能量最低化原理预测核酶的切割效率为Rz1RZ2RZ3.上述切点的共同特点是切点都位于RNA二级结构的单链状区域内，

8、切点两翼的碱基可形成环状突出结构，使整个二级结构形成锤头状，从而使核酶的切点充分暴露出来；同时核酶自身二级结构能够形成核酶切割所需的催化活性中心结构，有利于核酶与底物分子结合，提高核酶的切割效率.作者：谷仲平王耀程周勇安李谨革张涛陈农安【关键词】内皮生长因子Design and synthesis of vascular end 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。 图2pGEMRzVEGF质粒的转录略22核酶的合成按照计算机辅助设计的结果，分别

9、合成了带有黏性末端的Rz1，Rz2，Rz3基因，经酶切和测序鉴定，结果和设计的预期序列完全一致.其碱基序列如下：23自剪切转录载体的构建及其体外转录pGEMRz123经T7 RNA转录试剂盒体外转录，产物放射自显影可见3个条带，分别是Rz123（134 nt）、5 顺式核酶（64 nt）和3 顺式核酶（54 nt）（Fig 2）.这表明设计合成的自剪切转录载体发生了5和3 顺式核酶的自剪切，同时释放出了目的核酶.pGEMRz123经（Xba, Hind），（Hind, BamH）和（BamH, Aat）双酶切，体外转录分别得到Rz1，Rz2和Rz3，经测序分析结果正确.图3核酶Rz1,Rz2,

10、Rz3和Rz123对靶mRNA的切割作用略24核酶对靶RNA的切割作用Rz1，Rz2和Rz3分别将VEGF165 mRNA切割成110 nt和500 nt、190 nt和420 nt、250 nt和360 nt大小的两个片段；Rz123与底物作用，除可得到Rz1，Rz2和Rz3单独切割底物所见的上述片段外，还可共同作用产生80 nt和100 nt的片段（Fig 3），同理论预测结果一致.对底物的切割效率分别为Rz1(3710)%，Rz2(518)%，Rz3(6815)%，Rz123(8811)%，与计算机预测的一致.经方差分析Rz123，Rz1，Rz2和Rz3的切割效率存在显著差别（F=22.

11、81，P=0000），Rz123高于单独作用的核酶的切割效率(P005)，Rz1，Rz2和Rz3的切割效率两两间比较具有显著差异(P005).3讨论核酶由于具有诸多优点，作为抗肿瘤基因治疗的重策略之一，已引起人们的重视.核酶切割靶RNA效率的高低主取决于切点的选择和核酶的自身设计.理想的切点应符合 位于靶基因的重生物功能区，以使该基因被切割后其相应的功能丧失. 靶点及其周围序列具有高度保守性，使核酶的切割谱更广泛. 靶点附近的二级结构应使核酶易于接近. 核酶两侧的无关附加序列应较短6.然而，核酶切点的选择、核酶催化活性中心及其两侧碱基序列长度的确立和核酶表达质粒的设计，很大程度上依赖于研究者的

12、经验.目前切点的选择和核酶的设计有多种方法，计算机辅助设计核酶是一种常用、经济、方便和有效的方法，但它依赖于计算机软件的功能.我们采用的软件是经过实践不断修改而成的.本研究利用此软件设计合成的抗VEGF165多位点核酶，体外转录后能够高效定点切割靶RNA，表明我们的设计是正确的，计算机设计核酶是可靠有效的.核酶切割活性的发挥有赖于其空间结构的正确性.由于目前使用的核酶载体在转录和导入细胞后产生的核酶，其两侧的长片段附加序列（载体碱基序列）会阻碍核酶与靶RNA结合，同时核酶发挥作用后不能很快与靶RNA解离，影响了核酶的切割效率，而且长片段附加序列的合成增加了细胞RNA的合成量，对细胞的正常代谢存

13、在一定的影响.因此我们引入了5 cis和3 cis自剪切核酶，实验结果证实有效地去除了附加序列对核酶活性的影响7,8.研究发现由于存在靶RNA分子基因碱基突变、空间结构的多样性以及核酶同细胞内蛋白质因子结合的可能性，从而使一些单一核酶丧失切割靶RNA的活性.因此仅提高单一核酶的分子拷贝数，并不能有效地提高其在细胞内的切割活性.而多位点核酶可在某个单一核酶不能切割靶分子时，其他核酶仍有机会切割靶RNA，从而使其失去生物功能.在本研究中，不仅抗VEGF165多位点核酶中的单一核酶能够独自发挥作用，而且能够互相协同、互相促进而联合发挥作用.说明多位点核酶比单一核酶更有效.利用核酶抗血管生成治疗肿瘤具

14、有广阔的应用前景.本研究采用多位点核酶可定点高效地切割VEGF165 mRNA，为细胞内及在体应用核酶抗肿瘤血管生成奠定了基础.【参考文献】1 Gu ZP, Wang YJ, Li JG, et al. VEGF165 antisense RNA suppresses oncogenic properties of human esophageal squamous cell carcinoma J. World J Gastroenterol, 2002;8(1):44-48. 2 Perrone G, Vincenzi B, Santini D, et al. Correlation of

15、 p53 and bcl2 expression with vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) and clinicopathological features in colon cancer. Cancer Lett, 2004 ;208(2):227-234.3 谷仲平. 血管内皮生长因子与肺癌 J. 国外医学外科学分册, 2002;29(4):232234.Gu ZP. Vascular endothelial growth factor and lung cancer J. Forei

16、gn Med Sci Sect Surg, 2002;29(4):232-234.4 Song SI, Miller WA. Cis and trans requirements for rolling circle replication of a satellite RNA J. J Virol, 2004 ;78(6):3072-3082.5 陆长德, 陈农安, 祁国荣. 核酶对靶RNA的体外切割反应的计算机分析 J. 生物化学与生物物理学报,1996;28(3):279-285.Lu CD, Chen NA, Qi GR. Computer analysis of the cleava

17、ge reaction of hammerhead ribozyme J. Acat Biochim Biophys Sin, 1996;28(3):279-285.6 谷仲平. 血管内皮生长因子与肺癌. 核酶在肺癌基因治疗中的应用 J. 国外医学呼吸系统分册, 2003;23(3):141-143.Gu ZP. Application of ribozyme in lung cancer gene therapy J. Foreign Med Scien Sect Respir System, 2003;23(3):141-143.7 Gu ZP, Wang YJ, Wu Y, et al. Synthesis of ribozyme against vascular endothelial growth factor(165) and its biological activity in vitroJ.World J Gastroente