Gαi2对脑缺血—再灌注后神经细胞凋亡的影响 (1)

1、Gi2对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响 (1)    【摘要】目的 探讨分析抑制性G蛋白2亚单位（Gi2）在大鼠脑缺血-再灌注损伤模型海马中的表达及其对神经细胞内钙离子浓度和凋亡的影响。方法 将90只SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组（SS组，n=30）、脑缺血-再灌注损伤组（IR组，n=30）。脑缺血-再灌注且脑室内微量灌注Gi2活性抑制剂百日咳毒素（PT）组（PT组，n=30）；用免疫组化、Western blotting分别测定大鼠脑缺血-再灌注后6 h、12 h、24 h各组中海马神经内Gi2的表达，采用流式细胞术测定各组中海马细胞内游离C

2、a2+浓度的平均荧光值，TUNEL法检测神经元细胞的凋亡。结果 不同时间点，IR组Gi2含量和Ca2+浓度较SS组明显增高（P<0.01），PT组Ca2+浓度较IR组升高（P<0.01），PT组神经细胞凋亡率较IR组升高（P<0.05）。结论 Gi2在大鼠脑缺血-再灌注损伤中表达明显增高，并可降低缺血神经细胞内的钙离子浓度，减少神经细胞的凋亡，对缺血神经细胞具有保护作用。【关键词】抑制性G蛋白2亚单位；脑缺血-再灌注损伤；海马；百日咳毒素；凋亡；神经细胞；钙离子；死亡The effect of Gi2 on neuronal apoptosis in cerebral isc

3、hemia-reperfusion injury model of rats LI Jian， LIU Peng， LIAO Yi-liu.Department of Traumatic Surgery， Tongji Hospital， Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030，ChinaCorresponding author：LIAO Yi-liu， Email： yiliu.liao【Abstract】Objective To discuss the lev

4、els of inhibitory protein Ga-2（Gi2） in hippocampus of brain and the effects of Gi2 on neuronal intracellular Ca2+ level in cerebral ischemia reperfusion injury model of rats. Methods Ninety SD rats were randomly（random number） assigned to sham group （n=30）， ischemic-reperfusion （IR） group （n=30）， Pe

5、rtussis toxin （PT） group （n=30）. The blood flow of right common carotid artery of rat was blocked for 90 min to make ischemia reperfusion model. The levels of Gi2 in hippocampus was assayed by immunohistochemistry and Western blotting after ischemia reperfu-sion for 6，12，24 h in each group. The aver

6、age fluorescence values of intracellular Ca2+ levels in hippocampus of rats in three groups were detected by using Flow CytoMeter （FCM）. Neuronal cell apoptosis was measured by TUNEL.Results After restoration of middle cerebral artery blood flow for different lengths of time， the levels of hippocamp

7、us Gi2 and Ca2+ levels in IR group were significantly higher than those in Sham group （P<0.01）. The hippocampus Ca2+ levels in PT group were higher than those in IR group（P<0.01） . The apoptotic rates of neurons in PT group were lower than those in IR group （P<0.05）.Conclusions The level of

8、 Gi2 in cerebral ischemia reperfusion injury model was increased. Gi2 might reduce the calcium ion concentration of neurons after cerebral ischemia and reduce the neuronal cell apoptosis in this model. Gi2 might play a role in protecting neuron from cerebral ischemia reperfusion injury.【Key words】Gi

9、2；Cerebral ischemia reperfusion injury；Hippocampus；Pertussis toxin；Apoptosis；Neuron；Ca2+；Death 脑缺血-再灌注损伤机制中，细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后共同通路，它促发多种病理损害过程，如炎症、自由基的形成、膜降解、线粒体功能紊乱等，最终介导细胞不可逆性死亡1。G蛋白 （G protein）是一种在质膜蛋白中广泛存在的信号转导蛋白，其表达水平及活性的变化相应地调节着细胞生理、生化以及相应基因的表达，在细胞信号转导过程中起着“分子开关”的作用2-3。G 蛋白依其结构和功能主要分为刺激性G蛋白（Gs）

10、和抑制性G蛋白（Gi）。抑制性G蛋白亚单位（Gi）有3个亚型，即Gi1、Gi2和Gi3。Gi2具有抑制腺苷酸环化酶（AC）活性作用，与磷脂酶C依赖的磷酸肌醇脂水解、钾通道激活和调 节Ca2+通道开放有关。心脏的兴奋收缩偶联中，Gi蛋白介导的信号机制调节钙离子通道。在Gi2基因敲除和Gi2蛋白抑制的大鼠中，心肌缺血损伤更严重2，4。本实验旨在研究大鼠脑缺血-再灌注损伤中Gi2的表达变化和对神经细胞内钙离子浓度和细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1 试剂及仪器百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、抗Gi2抗体购自sigma公司，Fluo-3AM钙离子试剂盒购自碧云天公司，流式细胞仪（

11、BECKMANFC500 MPL）。1.2 动物模型制作及分组普通级健康雄性SD大鼠90只，体质量200250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，颈正中切口，暴露右侧颈总及颈内外动脉，在距颈总动脉叉1 cm处及远心端结扎颈外动脉并于中间剪断颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，于颈外动脉结扎处近心端0.5 cm处剪一切口，将一端稍膨大尼龙线蘸取肝素，由颈外动脉切口向颈内动脉插入至（20±1.5）mm有轻微阻力感停止，颈外动脉游离端近切口处结扎固定线栓，消毒缝合皮肤，并将线栓尾端留置于体外。缺血90 min后，向外抽线栓，使其头

12、端沿颈内动脉回到颈外动脉主干中，恢复大脑中动脉血流。将实验动物随机分为3组，每组27只，各组动物模型建立成功后按再灌注时长分为6、12、24 h 3个亚组，其中PT组为造模前于前囟向后0.8 mm中线旁开1.5 mm处，钻开颅骨并挑破硬脑膜后，用微量注射器垂直进针3.8 mm，于右侧侧脑室内灌注Gi2活性抑制剂百日咳毒素PT 10 g/kg，IR组则右侧侧脑室给予等量生理盐水， 假手术组仅暴露三条颈动脉，到相应时间点处死取海马组织。1.3 测定指标1.3.1 Gi2蛋白测定 取海马区脑组织，免疫组化法（SABC法）染色Gi2蛋白。取适量RIPA裂解液匀浆海马组织，测蛋白浓度后，各样品取50 g

13、/总蛋白上样电泳，行Western blotting。1.3.2 细胞内游离Ca2+ 浓度测定 大鼠断头处死后冰盘上迅速取脑组织海马区，碎成1 mm的小块，0.25%胰蛋白酶在37.0水浴箱中消化后，200 目尼龙网过滤去除细胞团块，离心（1000 r/min，5 min），弃上清，PBS重悬细胞，加入Fluo-3AM-DMSO标记，流式细胞仪测其荧光值。1.3.3 细胞凋亡测定 大鼠海马组织TUNEL染色，测定神经细胞凋亡率。1.4 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，单因素方差分析（one-way ANOVA）， SNK-q检

14、验 进行两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 Gi2蛋白表达采用免疫组化方法对脑缺血-再灌注损伤模型脑内Gi2表达进行检测，IR组Gi2蛋白表达明显增多，见图1。2.2 Western blotting相对应时间点，IR组中Gi2表达量显著高于SS组（P<0.01），PT组与IR组Gi2表达量无显著变化（P>0.05）。见图2和图3。2.3 Ca2+ 浓度SS组6 h，12 h，24 h海马细胞内游离Ca2+浓度平均荧光值X-mean值分别为1.132±0.463、1.096±0.302、1.072±0.382，IR组中相

15、对应时间点平均荧光值显著高于SS组（P<0.01），且随着再灌注时间的延长，IR组间和PT组间X-mean值逐渐升高，即Ca2+浓度升高（P<0.01）。相比较IR组相对应时间点，PT组Ca2+浓度降低（P<0.01）（图4和图5）。2.4 细胞凋亡TUNEL染色阳性为细胞呈棕黄色颗粒（图6），随再灌注时间延长，IR组和PT组的凋亡细胞数逐渐增加；相对应时间点，PT组神经细胞凋亡数较IR组升高（P<0.05）（图6和图7）。3 讨论在脑缺血-再灌注损伤过程中，细胞内外Na+/ Ca2+交换异常，钙泵（Ca2+-ATPase）数量及活性下降，炎性反应和大量的自由基损伤生物

16、膜使膜通透性增大及线粒体结构功能障碍等，这一系列的变化将导致神经细胞内Ca2+升高。当Ca2+内流过多和/或胞内线粒体及内质网储存Ca2+释放入胞浆过多时，将引发神经细胞内钙超载 5-7。钙超载发生后，一方面线粒体摄取细胞内钙使胞浆内钙向线粒体转移，然而过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合形成不可溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少8。同时Ca2+也可与通透性转运孔相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，引起神经细胞死亡或凋亡。另一方面，细胞内游离钙增加，可激活多种钙依赖性的酶促蛋白，包括磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶（AC） 、CaM依赖性蛋白激酶（CaMPK），通过基质水解，损

17、伤细胞膜，促进自由基生成、激活非选择性离子通道等途径产生细胞毒性作用引起神经元功能和结构完整性的破坏，最终导致细胞死亡或者凋亡9-12。 目前对于Gi2在脑缺血-再灌注损伤中的作用还未完全阐明，本组实验结果表明，在大鼠脑缺血-再灌注损伤模型中，脑缺血-再灌注组（IR组）Gi2蛋白表达较SS组明显增高（P<0.01），缺血-再灌注且脑室内微量灌注Gi2活性抑制剂（百日咳毒素）即PT组神经细胞内的Ca2+浓度和神经细胞凋亡率均较IR组明显升高，分别为P<0.01和P<0.05。这些结果表明Gi2可降低缺血神经细胞内的钙离子浓度，减少神经细胞的凋亡，对缺血的神经细胞具有保护作用。G

18、i家族的蛋白能与GPCRs相互作用，被认为是一个非常重要的药物靶向蛋白13。在中枢神经系统中，Gi2的含量比较高。Gi可抑制腺甘酸环化酶活性，降低细胞内环磷腺苷（cAMP）含量，维持细胞功能和结构的稳定，且Gi可抑制N和P/Q型钙通道。对Gi2基因敲除鼠的离体研究表明，在外周组织中，Gi2通过对AC和钙离子通道的调节而介导神经递质的释放14-15。最近有人用脑室内灌注Gi2的反义寡核苷酸链，可以造成脑室扩张13。陈莹莹和夏强16对缺血心肌细胞的研究认为，Gi/o蛋白可能通过PLC/PLD（磷脂酶D/磷脂酶C）激活蛋白激酶C（PKC）。PKC一方面增强PLD的活性，持续激活PKC，另一方面抑制P

19、LC对肌醇磷酸的水解，并促进三磷酸肌醇（IP3）的降解，减少细胞内Ca2+浓度的异常升高，从而对缺血心肌细胞起到一定的保护作用。另有研究表明17-19，Gi2能够介导大鼠心肌缺血性损伤过程中的心肌保护作用。在中枢神经系统，我们的实验结果表明Gi2对缺血的神经细胞也具有保护作用，且这种作用很可能是通过抑制细胞内钙离子的异常升高来实现的。钙离子拮抗剂对脑缺血损伤具有保护作用，尼卡地平联合异丙酚预处理能减少沙鼠缺血后再灌注神经细胞的凋亡20。参考文献1Vannucci RC， Brucklacher RM， Vannucci SJ. In tracellular calcium accumulati

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29、c injury is modulated by endogenous RGS proteins in the mouse heart J. Cardiovascular Research，2011， 91：45-52.20王屹，柳子明，周海燕. 尼卡地平联合异丙酚预处理对沙鼠缺血后再灌注神经细胞凋亡的影响J. 中华急诊医学杂志，2003， 12（5）：312-314.（收稿日期：2012-04-26）（本文编辑：何小军）DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.12.002基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目（2009-1001）；湖北省自然科学

30、基金资助项目（2011CDB543）作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科通信作者：廖忆刘，Email：yiliu.liao中华急诊医学杂志2012年12月第21卷第12期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.12tion during ischemia in pyramidal neurons J. Free Radic Biol Med，2001，31（10）：1216-1227. 13M?nkk?nen KS， Hakum?ki JM， Hirst RA， et al. Intracerebroventricu

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