p16基因突变及蛋白表达异常与人胰腺癌关系的研究

1、    p16基因突变及蛋白表达异常与人胰腺癌 关系的研究        【摘要】目的研究p16基因的突变及蛋白表达异常在人胰腺癌发生及侵润转移中的作用。方法应用PCR、PCR-SSCP、DNA测序及免疫组织化学技术，对35例人胰腺癌的p16基因第2外显子进行了检测，研究p16基因的突变及蛋白表达情况。结果12例在p16基因第2外显子部分存在至少522 bp的纯合缺失。7例存在2个点突变(突变位点均相同)：其一为第126密码子碱基GTCAAT的错义突变，氨基酸由缬氨

2、酸(Val)变成了天冬酰胺(Asn)；另一为第127密码子GCA-GCG的同义突变。缺失及突变共占54.3%(19/35)。P16蛋白三维结构模拟提示，Val 126Asn对蛋白空间结构有一定影响，从而影响P16蛋白的功能。12例缺失标本呈现P16蛋白表达阴性，9例标本(其中7例点突变)出现P16蛋白表达下降，共占60%(21/35)。结论p16基因的突变及蛋白表达异常，与人胰腺癌的发生、侵润转移及临床分期有明显的相关性，且有助于判断胰腺癌的恶性程度和患者的预后。【关键词】胰腺癌；p16基因；三维结构 Study on the relationship of alteration and ex

3、pression of p16 gene to pancreatic carcinomaZHOU Jiahua, YANG Detong, ZHANG Lishan, SU Zhanhai(Department of Bile-pancreatic Surgery, the Genetic Centre, the Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College, Nanjing, Jiangsu, 210009 P.R. China. E-mail:zhoujiahua)WANG Jin,FAN Yao(The National K

4、ey Opening Laboratory of Biology and Medicine and Pharmacology Technology, Nanjing University, Nanjing, Jiangsu, 210008 P.R. China)YAO Qing(Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College, Nanjing, Jiangsu, 210009 P.R. China)【Abstract】ObjectiveTo directly investig

5、ate the effect of genetic alteration(homozygous deletion and point mutation) and expression of p16 gene on pancreatic carcinomas. MethodsThirty-five cases were analyzed for genetic alteration and expression of p16 gene by polymerase chain reaction(PCR), single strand conformation polymorphism(SSCP),

6、 DNA sequencing and immunohistochemical method. ResultsThe analysis of pancreatic carcinoma for p16 gene revealed alteration in 19 of 35 cases, among which 12 pancreatic carcinomas had 522 bp homozygous deletion at least and 7 cases had two point mutations at the same site. One of them is 126th codo

7、n GTCAAT (Val126Asn); the other is 127th codon GCAGCG (A127A). The 3D (three-dimensional)structure of P16 protein determined by computer techniques according to PDB indicated that Val126Asn influenced the space structure of P16 protein and affected the function of P16 protein. Twelve cases revealed

8、no P16 protein and 9 cases showed low level expression of P16 protein. ConclusionThe alteration of p16 gene and abnormal expression of P16 protein are significantly correlated with the biological behavior and clinical staging of pancreatic carcinoma and may hence be helpful to prognostication.【Key w

9、ords】pancreatic carcinoma;p16 gene;three-dimensional structure人胰腺癌是常见的肿瘤之一，其发病率呈上升趋势。临床难以早期发现，且进展快、易转移，5年生存率在5%以下，死亡率高。近年来研究发现，抑癌基因p16失活与人胰腺癌有较为密切的关系。我们应用聚合酶链反应(PCR)-单链构像多态性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)结合DNA测序及免疫组织化学技术，对35例人胰腺癌的p16基因外显子2进行了检测，探讨p16基因变异和蛋白异常表达与人胰腺癌生物学行为及临床分期的关系。1对

10、象与方法1.1标本采集及临床相关资料35例人胰腺癌患者的癌组织及癌旁正常组织，其中12例为新鲜外科手术标本，23例为石蜡块标本。分别由南京铁道医学院附属医院、江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院提供并鉴定。男女为43，年龄最大74岁，最小19岁，平均61岁。1.2DNA模板的制备基因组DNA提取按常规酚氯仿异戊醇方法制备，对石蜡标本连续切片4 m×10片、脱腊、水化，再按酚氯仿异戊醇方法提取。提取后分别用琼脂糖凝胶(含EB)电泳，定性检查有无降解，并用DU-70紫外分光光度计进行定量检测纯度，A260A280比值在1.51.9之间较佳(A为吸光度，旧称光密度OD)。1.3PCR-SSCP银

11、染为p16基因的第2外显子设计套式PCR扩增的4对引物(1对外侧，3对内侧)，由中国科学院上海生物工程公司合成，见表1。每对引物稀释成10 pmol/l。第1轮PCR扩增外侧522 bp的片段，反应体系为10×反应缓冲液5 l、DMSO2.5 l、25 mol/L Mg2+1.5 l、10 mol/L dNTP 1l、10 pmol上下游引物各4 l、基因组DNA0.3 g(6 l)、TaqDNA聚合酶2.5 U，总体积50 l，循环参数：955 min、9530 s、50 30 s、72 75 s，35个循环，72延伸10 min；第2轮PCR分别扩增158 bp、150 bp及1

12、40 bp的片段，反应体系以上一轮PCR扩增产物为模板1100稀释6 l、10×反应缓冲液5 l、25 mol/L Mg2+1.5 l、10 mol/L dNTP 1 l、上下游引物各4 l、TaqDNA聚合酶2.5 U，总体积50 l，循环参数：943 min、94 30 s、5030 s、7245 s，35个循环，72延伸5 min。取12 l的PCR扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳，以100 bp DNA ladder marker作标记。检测PCR扩增产物的浓度及纯度，有无出现缺失，对出现缺失的标本及未缺失的标本进行重复并加-actin对照引物进行PCR扩增，出现180 bp条带

13、而未出现522 bp条带为缺失。取未发生缺失的PCR产物变性后经8%12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶恒压500 V、温度15电泳4 h，银染分析。表1PCR扩增及套式扩增的p16基因的引物序列和片段Table 1 The primer sequence and product of PCRPrimer(引物)Primer sequence(引物序列)Size(bp)(长度)(bp)p16extra(外侧)5-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCA-35225-GAGAACTCAAGAAGGAAATTGG-3intra(1)(内侧)5-CATTCTGTTCTCTCTGGCAG-31585-CAC

14、CACCAGCGTCTTCCAGGAA-3intra(2)5-GACCCGTGCACGACGCT-31505-GGTACCGTGCGACATCGC-3intra(3)5-TGGACCTGGCTGAGGAG-31405-CAAATTCTCAGATCATCAGTCCTC-3-actin5-CAACTCCATCATGAAGTGTAAC-31805-CCACACGGAGTAACTTGCGCTC-31.4DNA测序对有异常的140 bp片段重新进行100 l反应体系的PCR扩增，将PCR产物纯化后邮往大连宝生物工程公司进行DNA测序。1.5P16蛋白三维空间结构模拟P16全套原子坐标由In-Ja L.

15、Byeon & Ming-Daw Tsai教授(美国Ohio State University)提供，将获得的原始原子坐标进行能量优化以释放可能存在的不合理原子接触等。将126Val残基改为Asn，为模拟该突变体结构，进行能量优化过程。首先进行500最陡下降法(SD)，然后再进行共轭梯度法优化。为避免陷入局部能量极小，采用模拟退火方法对系统先升温至1000 K，再降至300 K并平衡，进行8 ps的动力学构象空间搜索。再采用SD法和共轭梯度法进行能量优化，获得初步优化的突变体结构。1.6免疫组化采用敏感的LSAB技术：石膜包埋组织作4 m厚的切片，常规脱腊水化。将切片置于0.01 mo

16、l/L柠檬酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉煮沸10 min修复抗原，取出待冷却至室温后，用蒸馏水洗3次，继用0.3%H2O2-甲醇常温下孵育切片10 min,以阻断内源性过氧化物酶。擦去周围PBS，滴加封闭剂，置切片于湿盒中孵育37 20 min，吸去封闭剂(勿洗)，用P16抗体(santa cruz)120浓度滴加，37孵育1 h，4湿盒过夜，切片用PBS洗3次×5 min。滴加LSAB(DAKO公司)二抗工作液，置切片于湿盒中37孵育30 min，PBS洗3次×5 min。滴加LSAB的三抗工作液(即ABC)置切片于湿盒中37孵育30 min，PBS洗3次×

17、5 min，将DAB以DAB工作液稀释50倍滴加到切片上，显色510 min(在显微镜下控制显色)后用自来水冲洗3 min终止，用苏木素复染11.5 min，冲洗10 min，脱水、透明、封片、镜检。1.7统计学分析计数资料根据四格表精确概率法进行处理，根据FI值决定P值大小。 2结果2.1外显子2缺失的结果以522 bp的外侧引物对35例胰腺癌进行PCR扩增，其中有12个标本缺失。为排除实验误差，对上述标本进行重复扩增，并加-actin引物(扩增片段180 bp)进行内对照。以100 bp ladder的marker(Gibco)为标志，确认12个标本有p16基因的缺失，缺失率为34.3%，

18、见1。中显示肿瘤标本未出现522 bp的条带，但出现180 bp的对照条带，而癌旁正常标本同时出现180 bp和522 bp的条带。1p16基因外显子2缺失情况M：标志；T：肿瘤；N：癌旁标本Fig 1Exon 2 homozygous deletion of p16 geneM:marker of 100 bp ladder; T:tumor; N:normal2.2SSCP银染筛查对158 bp、150 bp的扩增产物进行SSCP筛选，未发现异常。对140 bp的片段进行SSCP筛查，发现有8例出现单链DNA泳动速度的变化，为防止误差进行重复，阳性率为23.3%，见2。中显示癌旁正常标本出

19、现4条带，而肿瘤标本出现3条带或2条带。2胰腺癌组织p16基因第2外显子140 bp扩增片段SSCP结果T：肿瘤；N：癌旁标本Fig 2 140 bp of exon 2 of p16 gene in pancreaticcarcinoma by SSCP T:tumor; N:normal2.3DNA测序结果SSCP测出的8个异常标本中有7个出现DNA序列的变化，突变位点相同。第126密码子碱基GTCAAT，为错义突变，氨基酸由Val变成了Asn；第127密码子GCAGCG为同义突变，氨基酸仍为Ala。阳性率为20%，1个标本无变化，见3。3DNA测序结果上为癌旁标本；下为肿瘤Fig 3 T

20、he results of DNA sequencing up:normal; down:tumor2.4P16蛋白三维空间结构模拟结果见4，5。正常P16蛋白是由4个回钩状重叠的空间构型结构蛋白，其中每个回钩由2个螺旋组成，它是P16蛋白的活性中心，也是和CDK4作用的部位。而外显子2缺失标本的P16蛋白已没有完整的空间结构。4显示突变型(Va1126Asn)P16蛋白的三维空间结构在第3个回钩有一定程度的变化。进一步从显示了残基126位附近空间距离4Å范围内的原子相互作用情况来看，5B显示了126Asn的酰胺基与对面相邻的helix(90100位残基组成)上的91、94位残基主链

21、形成了2个氢键，在一定程度上破坏了该helix的二级结构，使得两残基的C距离增加了1Å；此外该回钩内部存在1个由疏水侧链(8991，94)组成的疏水中心与1个由(123125)位荷电残基组成的极性中心，由于126位Val变为Asn引入极性侧链，使得两中心的平衡有所偏移，极性中心增强，疏水中心减弱。4P16蛋白以条带形式表现的三维空间结构Fig 4 3D structure of P16 with backbone5126位Val/Asn残基附近空间距离4Å范围内的原子相互作用(90100，123134)Fig 5 The interaction of atom within

22、 4Å range at amino acid position 126Val/Asn(90-100,123-134)6胰腺癌p16蛋白表达阳性(×200)Fig 6 The expression of P16 protein ?(×200)2.5免疫组化结果我们对35例胰腺癌标本及正常组织进行p16蛋白的免疫组化分析，以已知乳腺癌阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，以正常胰腺组织作正常对照。胞浆染成棕黄色作为阳性判断标准，按无阳性瘤细胞或阳性瘤细胞数表达10%为阴性，阳性瘤细胞细胞数表达25%为“+”，细胞数占25%50%为“”，细胞数50%为“”。发

23、现有21个标本出现不同程度的P16蛋白表达下降(12例阴性，9例“”)，与p16基因改变相比，有2例未出现基因改变而蛋白表达下降。6中胞浆棕黄色的颗粒为P16蛋白，而细胞核被复染成蓝色。2.6p16基因变异及蛋白表达与人胰腺癌相关性的统计学分析结果分析表明p16基因的突变与人胰腺癌患者性别、年龄及病理类型无明确的关系，而与侵润程度及淋巴结转移有明确的关系，见表2。表2人胰腺癌生物学行为与p16基因突变及蛋白表达的关系Table 2 The relationship between mutation and expression of p16 gene and biological behavi

24、or of human pancreatic carcinomaBiological behavior(生物学行为)p16 gene(p16基因)P16 protein(P16蛋白)No. of mutation(突变例数)No. of normal(未突变例数)Low expression(表达下降)Normal expression(表达正常)Age(年龄)59.78±12.7361.33±8.5560.86±12.3160.27±8.10Sex(性别)male(男性)119119female(女性)87105Pathology type(病理分型)

25、papiliary adenocystoma(乳头状囊腺瘤)1212cystadenocarcinoma(囊腺癌)2121duct cell adenocarcinoma(导管腺癌)1411169mucinous adenocarcinoma(粘液腺癌)2121adenosquamous carcinoma(鳞癌)0101Histologic differentiation(分化程度)well-diff.(高)1414mod-diff.(中)107107poorly-diff.(低)85103Invasion stage(浸润程度)invasive(累及周围脏器)168*177*non-inv

26、asive(未累及周围脏器)3847Lymphnode metastasis(淋巴结转移)present(有)135#153#absent(无)611611TNM stage(TNM分期)(期)2323(期)4848(期)113122(期)2231* P0.05(FI=4.56)；* P0.05(FI=4.68)；#：P0.05(FI=3.59)；#：P0.05(FI=8.29)；：P0.05(FI=5.67)；：P0.05(FI=7.96)；No. of mutation and expression of p16 gene of patient with TNM was significa

27、ntly more than that of and (期与期+期相比差异有显著性)3讨论p16基因是第1个被证明为肿瘤抑制基因的细胞调控机理的内在成分，从根本上连接了曾一度互不相关的两个研究领域细胞周期调控与肿瘤抑制剂，是近年来肿瘤分子生物学研究的一个热点1。研究发现p16基因与人胰腺癌有较为密切的关系。Caldas等2在对胰腺癌的研究中发现，10种细胞株中5个缺失、3个突变，总失活率达80%；而在27例原发肿瘤中有10个标本缺失，占37%；有11个标本发生点突变，占41%。也有低于该比例的报道3，4，但p16缺失率相似约在40%左右。最近Muscarella等5报道12例原发肿瘤标本中p1

28、6基因缺失率为41.7%，甲基化为58.3%。我们在35个病例中发现有12个标本缺失(占34.3%)，7个发生点突变(占20%)，总突变率为54.3%，低于上述报道。可能的原因有：(1)种族差异；(2)在标本采集时混入正常细胞而干扰了实验结果；(3)仅做了外显子2。我们用PCR-SSCP筛查出的8个异常标本的140 bp扩增产物，DNA测序显示7个标本DNA序列有变化，而1个标本无变化。其原因可能是由于在测序时开始的一段碱基测不出来，而突变位点恰好在该区域。目前通过DNA序列测定突变位点较多6-8，主要有移码突变、错义突变及无义突变。我们的研究发现7个标本存在2个点突变，突变位点均相同，一为第

29、126密码子碱基GTC突变为AAT，氨基酸由缬氨酸(Val)变成了天冬酰胺(Asn)，引起野生型P16蛋白表达下降；另一为第127密码子GCA-GCG，氨基酸仍为丙氨酸，为同义突变，突变位点与上述报道相同。同义突变可使偏爱密码子变成非偏爱密码子，从而导致相应的tRNA由多数型转为少数型，结果使该密码子的表达明显减低，影响蛋白质的合成，造成了蛋白表达的下降。P16蛋白(156个氨基酸)主要是由4个锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)构成，重复序列在抑制作用中占主要地位。体外实验同样证明，在锚蛋白重复序列以外区域发生p16基因的变异对P16蛋白的功能没有影响6，说明锚蛋白重复序列决定P1

30、6蛋白的功能。本研究中第126位密码子突变和外显子缺失刚好在重复区域范围内，从而影响P16蛋白的功能。从模拟突变型P16蛋白结构来看，初步结构模拟显示所在helix(123134)与相对应的野生型主链结构比较的RMS为1.24Å，其对面相邻的helix(90100)与相对应的野生型结构比较发生了RMS为1.76Å的偏离。突变对P16蛋白的结构和功能产生了相应的影响。当然可通过进一步模拟野生型P16蛋白及蛋白突变体与CDK4对接Docking相互作用，获得该突变体对P16蛋白的结构和功能的详细影响8。细胞中野生型P16蛋白含量较多，所以用一般的免疫组化检测到的P16蛋白是野生

31、型而非突变型，有较高的临床应用价值。我们用LSAB方法对35例胰腺癌进行P16蛋白表达研究，有21个标本出现不同程度的P16蛋白表达下降(12例阴性，9例“”)，占60%，从而不能抑制肿瘤生长和转移。其中有2例P16蛋白表达下降，但并未发现基因缺失或突变，可能有两种原因：(1)p16外显子1或3发生改变；(2)p16基因除缺失、突变外，有其它机理如甲基化的参与5。我们应用PCR-SSCP、DNA测序技术对35例人胰腺癌标本及癌旁组织中p16基因外显子2区域进行了突变检测，发现有54.3%的病例p16基因变异，并用免疫组化方法检测有60%的病例P16蛋白表达下降，从而证实了p16基因突变参与了人

32、胰腺癌的发生。一般认为，人胰腺癌分化程度低、浸润广泛、及临床分期处于-期的患者预后较差。我们的结果经统计学分析表明，p16基因的突变及蛋白表达异常与胰腺癌患者的性别、年龄及病理类型无明确的关系；分化程度高的人胰腺癌标本p16基因及蛋白表达下降率为20%(1/5)，而中、低分化突变率为60%(18/30)，蛋白表达下降率为66%(20/30)，说明分化程度低p16失活高，但差异无显著性，可能与病例少有关。统计学分析还表明，p16基因的突变及蛋白表达异常与侵润程度及淋巴结转移有明确的关系，以及临床分期期有明确的关系，我们尚未进行进一步术后随访。Bartsh等9报道p16基因突变与胰腺癌期有相关性，

33、而术后随访发现发生p16突变的患者平均存活5个半月，无p16突变的患者平均存活19个月，差异明显。Naka等10用免疫组化方法检测P16蛋白表达，发现P16蛋白表达阴性与临床分期有关，5例P16蛋白表达阳性的患者存活3年，而阴性病例存活很短，说明p16基因的检测对人胰腺癌的诊断及预后判断有重要的临床意义。 作者单位：周家华（南京铁道医学院第一附属医院胆胰外科210009）杨德同（南京铁道医学院第一附属医院胆胰外科210009）张丽珊（遗传中心）苏占海（遗传中心）姚青（病理科）王进（南京大学医药生物技术国家重点开放实验室）范?（南京大学医药生物技术国家重点开放实验室）参考文献1，Mar

34、x J. New tumor suppressor may rival p53. Scinece, 1994, 264344-345.2，Caldas C, Hahn SA, da Costa LT, et al. Frequent somatic mutation and homozygous deletions of p16 (MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.Nat Genet, 1994, 827-32.3，Huang L, Goodrow TL, Zhang SY, et al. Deletion and mutation analyse

35、s of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in human ductal pancreatic cancer reveals a higher frequency of abnomalities in tumor-derived cell line than in primary ductal adenocarcinomas. Cancer Res, 1996, 561137-1141.4，Bartsh D, Douglas W, William S, et al. Frequent mutations of CDKN2 in primary pancreatic adenocarcin