下咽鳞状细胞癌中Slit2的表达及其与微血管密度关系的临床研究

1、下咽鳞状细胞癌中Slit2的表达及其与微血管密度关系的临床研究    作者：姚磊,张中华,马超,雷大鹏,潘新良作者单位：1. 山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科； 2. 山东大学卫生部耳鼻喉科学重点实验室， 济南                             

2、0;                       【摘要】目的 研究下咽鳞状细胞癌组织中神经迁移蛋白Slit2的表达及其与微血管密度的关系，探讨两者对下咽鳞状细胞癌的生物学行为的影响。方法 免疫组织化学法检测Slit2蛋白的表达及微血管密度（MVD），并应用RTPCR法检测新鲜组织中Slit2 mRNA的表达。研究其表达与肿瘤临床特征的关系。结果 Slit2蛋白在下咽鳞状细胞癌

3、和癌旁组织中的表达率分别为65.2%和40.5%，两者表达差异有统计学意义（2=6.329，P<0.05）；Slit2 mRNA在下咽鳞状细胞癌和癌旁组织中的表达，差异亦具有统计学意义（t=8.230,P<0.05）。Slit2蛋白的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移显著相关；MVD计数与肿瘤大小、浸润深度、TNM分期和淋巴节转移显著相关，两者与肿瘤的发病年龄、部位、临床病理分化程度均无关。肿瘤组织中Slit2阳性表达者MVD计数高于Slit2阴性表达者，其差异具有统计学意义（t=2.273,P<0.05）；并且两者表达呈正相关（rs=0.430，P<0.05）。结

4、论 下咽鳞状细胞癌组织中Slit2表达和MVD计数，与肿瘤的侵袭和淋巴结转移密切相关，其机制可能为SlitRobo信号系统介导了肿瘤新生血管的形成，从而影响了肿瘤的生物学行为。 【关键词】  蛋白Slit2；下咽肿瘤；免疫组织化学；微血管密度     density in hypopharyngeal squamous cell carcinoma     YAO Lei1, ZHANG Zhonghua1, MA Chao2, LEI Dapeng1,PAN Xinliang1     (1.

5、 Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;     2. Key Laboratory of the Ministry of Health ENT，Shandong University, Jinan 250012, China)     To investigate expression of Slit2 and its correlation

6、 with microvessel density in human hypopharyngeal squamous cell carcinomas, and to analyze their influences on the biological behavior of human hypopharyngeal squamous cell carcinoma. Methods  Expressions of Slit2 and CD34labeled microvessel density (MVD) were measured by immunohistochemical st

7、aining (Envision), and expression of Slit2 mRNA in 24 cases of fresh tissues was determined by reversetranscript polymerase chain reaction.  Results  The positive rates of Slit2 in cancerous tissues and paracancerous tissues were respectively 65.2% and 40.5%（2=6.329，P<0.05）. Slit2 mRNA

8、expressions between them also had statistical significance (t=8.230, P<0.05). Expression rate of Slit2 and  enumeration of MVD were significantly associated with tumor size，TNM stage, and lymph node metastasis. Enumeration of MVD was increased in  Slit2positive tissues（t=2.273, P<0.0

9、5）. Expression of Slit2 had a positive correlation with MVD（rs=0.430，P<0.05）. Conclusion  Expression of Slit2 and enumeration of MVD are significantly higher in hypopharyngeal squamous cell carcinoma than in normal mucosa. They have significant relations to tumor invasion and lymph node meta

10、stasis，and the mechanism might be that Slit2 mediated new vessel formation in tumors.     Key words: Slit2; Hypopharyngeal neoplasms; Immunohistochemical staining; Microvessel density     神经迁移蛋白Slit是1984年NussleinVolhard等在果蝇体内发现的分泌型的细胞外基质蛋白，由基因4p15.2编码，有多个蛋白质结合区域1。哺乳动物体内

11、的Slit有3个亚型，均在神经系统表达，不仅仅能够影响神经元轴突（或是胞体）的迁移,还能够抑制趋化因子诱导的白细胞的迁移2。后二种亚型还存在于哺乳动物神经外系统中，特别是肿瘤细胞中。Wang等3研究证实，在结肠癌、乳腺癌、胃癌等实体瘤中均有Slit2蛋白的表达,同时血管内皮细胞上有Robo1表达，并首次报道了SlitRobo信号系统在肿瘤新生血管形成中发挥的重要作用。该研究将肿瘤细胞和血管内皮细胞之间新的"对话"机制引入到了肿瘤的发生和发展过程当中，为肿瘤的发病机制和治疗方法开辟了一个新的研究方向。下咽鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，有关Slit2蛋白的表达及其所诱导的新

12、生血管形成在下咽鳞状细胞癌中的报道甚少，本研究通过观察下咽癌组织中Slit2蛋白的表达及其与新生血管密度的关系，探讨Slit2基因在下咽癌的发生发展中的作用。     1  资料与方法         1.1  材料  选取2006年1月至2008年6月间，山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉头颈外科手术切除的下咽鳞状细胞癌组织66例、癌旁组织42例（距离肿瘤边缘2?cm），其中男61例，女5例，4974岁，平均63岁。所有患者术前未接受放射、化学、非甾体类抗炎药及免疫治疗，均

13、经病理组织学检查确诊为鳞状细胞癌。其中12例癌及癌旁组织为新鲜手术标本，以无菌手术刀片取下，用生理盐水冲洗血迹后分成两块，一块用10%中性甲醛固定，用于免疫组织化学染色；另一块在离体30?min内放入-80?冰箱中保存。其余标本均经甲醛固定后常规石蜡包埋, 4?m连续切片。根据国际抗癌联盟（UICC）1997年制定的下咽癌TNM分期法进行临床分期。     1.2  主要试剂  山羊抗人Slit2多克隆抗体（克隆号sc26599；1100）（Santa Cruz公司产）；鼠抗人CD34单克隆抗体（1：100）、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG二

14、抗（1：500）、二步法免疫组化试剂盒（PV9000）（北京中杉金桥公司产）；DAB 显色剂（上海华舜生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen公司产）；逆转录试剂盒（Promega公司）；PCR Mix（Takara公司）。     1.3  方法及结果判定标准     1.3.1  免疫组织化学法检测标本中Slit2蛋白的表达及检测微血管密度  免疫组织化学染色采用Envision二步法检测，常规脱蜡、梯度乙醇水化后微波修复抗原。30?mL/L过氧化氢甲醇溶液孵育10?min以灭活内源性过

15、氧化物酶，100?g/L BSA溶液封闭非特异性抗原，倾去BSA后滴加一抗，4?过夜。滴加兔抗山羊IgG二抗，37?孵育60?min，DAB 显色。苏木精复染，常规脱水，透明，封片。以已知阳性的下咽癌组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤严格按照说明书进行。     Slit2阳性染色为细胞质内出现棕黄色颗粒，阳性细胞为细胞着色且着色明显高于背景或背景不着色。每张切片根据阳性细胞百分数进行计数。计数方法：先在低倍镜下选取有代表性的视野再在高倍镜下计数，每例计数4个高倍镜视野至少200个细胞。Slit2阳性等级判定参考Mattern等4的方法并

16、加以改进：根据阳性细胞占总计数细胞的百分率分为四级：0%、11%、26%、51%100%，分别记为“-”，“+”,“+KG-*3+”,“+KG-*3+KG-*3+”。将“”记为阴性表达，“+”，“+”和“+”记为阳性表达。     MVD计数参照Maeda等5报道的方法,以CD34作为血管 内皮标记物。首先在低倍镜(100×)下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最大处,再在高倍镜(200×)下,以与周围肿瘤细胞和结缔组织成份明显区别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管,只要结构不相连,其分枝结构也作为一个微血管计数。记录5个视野内微血

17、管数, 取其平均数作为该张切片MVD值。     1.3.2  RTPCR法检测下咽癌中Slit2 mRNA的表达  参照Trizol 试剂说明书的操作抽提RNA，用分光光度计测定浓度之后，按照逆转录试剂盒的说明将RNA逆转录成cDNA，以actin为内参照，进行PCR 扩增。Slit2引物序列：上游引物为：5TGCCCATCAATGCGTTCTCCTAC3，下游引物为：5TCGTACAGCCGCACTTCACCACT3，扩增产物为421?bp，循环条件为：94?,5?min94?,45?s58?,45?s72?,45?s72?，45?s72?

18、，5?min，33个循环。actin引物序列为：上游引物为：5CCCCATCGAGCACGGCATCG3，下游引物为：5GGAGTCCTGTGGCATCCACG3，扩增产物为620?bp，循环条件为94?,5?min94?,45?s55?,45?s72?,45?s72?，5?min，26个循环。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳后，使用Quantity One软件分别对目的带进行量化。记录每个条带的灰度值,将实验组灰度值和与之相对应的内参照组灰度相比,得此比值作为Slit2 相对表达水平的参数。     1.4  统计学处理  应用

19、SPSS 13.0数据统计软件包进行统计分析，计数资料组间阳性率比较用成组2检验，两样本计量资料采用t检验及Spearman等级相关性分析，以=0.05作为检验标准。     2  结  果       2.1  Slit2蛋白在各组织中的表达及MVD计数  66例下咽鳞状细胞癌组织中，43例Slit2表达阳性（65.2%），阳性表达部位主要位于肿瘤细胞质内，棕黄色，颗粒状;在鳞癌癌巢的中心部位较周边部位表达更强（图1）。与癌旁组织相比，下咽癌的Slit2蛋白的表达水平增高具

20、有统计学意义（2 =6.329，P<0.05）（表1）。鳞癌组织中新生微血管排列紊乱，大小及密度不均，血管高密度区主要位于肿瘤边缘的间质内（图2）。     例数阴性2值P值MVD平均计数下咽鳞状细胞癌组织6643236.3290.01226.68±5.97癌旁组织42172519.92±3.732.2  下咽鳞状细胞癌中Slit2蛋白表达和MVD计数与临床病理特征的关系  下咽鳞状细胞癌中，Slit2蛋白的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴节转移显著相关；MVD计数与肿瘤大小、浸润深度、TNM分期和淋巴节转移显著相关。

21、两者与肿瘤的发病年龄、部位、临床病理分化程度均无关。66例下咽癌组织中，Slit2蛋白表达阳性43例，其MVD计数为27.87±5.61；Slit2蛋白表达阴性23例，其MVD计数为24.47±6.12，两者MVD计数差异具有统计学意义（t=2.273,P<0.05）。表 2  Slit2蛋白表达及MVD计数与下咽癌临床病理     特征的关系     nSlit2阳性阴性P值P值  60251690.87824.88±5.41>0.05  6041271427.

22、78±6.10肿瘤大小(cm)  23719180.01924.64±2.22<0.05  22923629.29±7.99病理分型  高/中分化4023170.10627.32±7.52>0.05  低分化2620625.69±1.71浸润深度  T1/T23019110.96324.54±4.11<0.05  T3/T436231328.61±6.60TNM分期  +2712150.00723.40±4.56<0.01

23、  +3930928.95±5.82淋巴节转移  有352780.01523.49±3.99<0.01  无31151630.28±5.82肿瘤部位  梨状窝区5434200.80926.98±5.73>0.05  下咽后壁区     和环后区128425.35±7.112.3  下咽鳞状细胞癌中Slit2蛋白表达和MVD的关系及其相关性分析  66例下咽鳞状细胞癌中，Slit2蛋白表达阳性者的MVD值比表达阴性者的MVD值高，两者差

24、别具有统计学意义。做spearman相关分析，结果显示两者在下咽鳞状细胞癌中存在正相关关系（rs=0.430，P<0.05）。     2.4  下咽癌组织中Slit2 mRNA的表达  12例下咽鳞状细胞癌组织Slit mRNA表达量较actin比值为0.90±0.23，12例癌旁组织的比值为0.32±0.09，肿瘤组织中Slit2 mRNA表达显著增高，两者差异具有统计学意义（t=8.230,P<0.05）。并且在12例下咽鳞状细胞癌组织中，有淋巴结转移，瘤体2?cm及TNM分期晚者均较无淋巴结转移，瘤体2?

25、cm及TNM分期早者的Slit2 mRNA表达强度要高（图3）。与免疫组织化学分析结果相符。图 3  Slit2 mRNA表达结果与临床病理特征分析图KH*2D3  讨  论     神经迁移蛋白是近年来在发育生物学中的研究热点，其主要功能是吸引或排斥神经元轴突的迁移，在神经系统中发挥着重要的作用。目前研究发现的神经迁移蛋白主要由Ephrin/eph，Semaphorin/Neuropilin，Slit/Robo和Netrin/UNC40四大家族成员构成。Slit蛋白是由神经系统中线的神经胶质细胞表达和分泌的一种大分子量的细胞外基质蛋

26、白。哺乳动物的Slit蛋白共有三型（Slit1Slit3），他们有60%的同源性6。人类Slit 2 蛋白经水解后产生1个N末端片段Slit2N和1个C末端片段Slit2C。Slit2N 包含4 个LRRs和5 个EGF 重复序列，Slit2C 包含蛋白质的其它部分。Slit2蛋白的全长和其片段都可被分泌到细胞外。Slit2蛋白的第二个LRR序列（Slit2 D2）参与和受体RoboN的两个Ig序列的结合形成Slit2 D2Robo Ig1复合体7,此即SlitRobo信号系统中的关键结合点。血管系统和神经系统具有十分相似的结构特征和发育机制。现在越来越多的实验证据表明SlitRobo信号通路

27、具有多种功能，其不仅在神经系统的轴突导向生长，神经元的迁移及白细胞趋化迁移中发挥着重要的作用，而且可以影响血管内皮细胞的生成和迁移，诱导肿瘤形成新生血管从而影响肿瘤的生物学行为。     肿瘤生长是血管依赖性的,若缺乏新生血管形成则肿瘤生长受限。在下咽鳞状细胞癌的发生，发展和转移的过程中，新生血管发挥着重要的作用。在肿瘤发生发展的早期，既无血管期或称为血管生成前期，瘤体较小，氧供和营养供应主要由周围毛细血管和组织间液渗透提供，能量供应部分依靠细胞的无氧酵解。此时肿瘤细胞数目有限且增殖缓慢，直径一般不超过12?mm，少有转移。随着肿瘤的体积增大，细胞数目的增多，此种

28、营养供应方式已不能满足肿瘤生长的需要，若无足够的血供，瘤体生长将受限并出现坏死810。Wang等3通过体外实验可观察到Slit2在细胞表面的定植与硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)成正相关，且TNFa、IL16能使Slit2表达增加，表明炎症前介质、低氧及癌基因表达与Slit2增加有关。LiJing Wang13等通过R5阻断化学诱导的鳞状细胞癌中SlitRobo信号系统，可以明显抑制新生血管的形成，从而进一步证实了该通路系统在新生血管形成中的诱导作用。根据本研究中Slit2表达及MVD计数在不同大小肿瘤中的差别具有显著统计学意义，可以推断，随着肿瘤增大，瘤体内出现缺氧、原炎症因子表达等改变，此种内

29、环境的变化启动了一系列的新生血管的生成程序，打破了血管生成和血管生成抑制在瘤体局部的平衡。这就包括Slit2 基因表达的上调，使SlitRobo信号系统激活，其中起主要作用的是Robo4蛋白（MRB）通过激活RasRafMekErk信号通路14，从而促进肿瘤新生毛细血管生成，为肿瘤的进一步生长提供营养，并为其转移提供必要的条件。     在本研究中，淋巴结转移组下咽癌的Slit2的表达和MVD计数明显高于非转移组；TNM分期晚、周围组织浸润明显者与TNM分期早且瘤体局限的肿瘤组织中Slit2的表达和MVD计数相比，均有增高。由此可以认为SlitRobo信号系统介导

30、的新生血管的形成在下咽癌的颈淋巴结转移和瘤体向周围浸润过程中发挥了重要作用。与正常的炎症反应过程中血管增生不同，在肿瘤新生血管生成过程中，Slit2表达失去正常的基因调控，呈现过表达。通过SlitRobo信号系统的激活不断诱导新生血管的形成，血管生成失去自控。肿瘤新生的毛细血管管壁薄弱，仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌组织，基底膜不完整，使它们比正常的成熟血管更容易被肿瘤细胞穿透，进而导致肿瘤转移的发生。有研究11发现，在新生血管形成过程中，与Slit类似的轴突排斥因子Semaphorins，可以通过抑制细胞外基质integrin及其配体的功能来调节胚胎内的血管形成。由此可以推断，Slit2Ro

31、bo信号系统在新生血管形成中，通过对基底膜和细胞外基质的降解诱导了内皮细胞的增生、迁移和分化，此过程中形成的胶原裂隙利于癌细胞对周围的侵袭；与此同时新生血管为肿瘤的生长侵袭提供了能量基础。以上机制维持了肿瘤细胞对周围组织侵袭的持续性。但是临床病例中下咽癌最早多为淋巴结转移，究其原因可以解释如下：毛细血管内的环境，如血流速度过快等因素，使癌细胞较难存活且不易粘附种植，在血管远端再次穿出血管壁而形成新的病灶的几率也很小。然而与毛细血管相比，毛细淋巴管壁更薄，没有基底膜，并且可见大量开放的裂隙，所以癌细胞更易侵入毛细淋巴管12。所以，SlitRobo信号系统所介导的肿瘤新生毛细血管的形成维持和加强了

32、肿瘤细胞的侵袭能力，并在侵袭和转移过程中通过增加血供的方式来提供营养支持。此外，在乳腺癌脑转移模型的最新研究中15，阻断CXCL12/CXCR4通路的化学趋化作用所介导的肿瘤转移机制后，Slit2蛋白可以直接诱导表达Robo蛋白的乳腺癌细胞的转移，从而证明了SlitRobo信号系统在肿瘤的侵袭和转移中的直接引导作用。此种机制在下咽癌的转移中可能也发挥着同样的功能，但尚需进一步的验证。     Slit2的表达及通过SlitRobo信号系统介导的肿瘤新生血管的形成在下咽鳞状细胞癌的发生、发展、浸润和转移过程中发挥着重要的作用。Slit2蛋白的表达强度及MVD的计数值

33、可以作为判断下咽鳞状细胞癌的生长、浸润及转移能力的重要指标。对肿瘤的辅助诊断和抗血管治疗具有重要的指导意义。其具体的作用机制还有待进一步的深入研究。 【参考文献】 1 NussleinVolhard C， Wieschaus E， Kluding H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster IZygotic loci on the second chromosomeWilhelm Rouxs ArchJDev Biol， 1984， 193(9):267283. 2 Wu

34、 J Y, Feng L, Park H T, et al. Slit, a molecule known to guide axon projection and neuronal migration, inhibits leukocyte chemotaxis induced by chemotactic factorsJ. Nature, 2001, 410:948952. 3 Wang B, Xiao Y， Ding B B， et al. Induction of tumor angiogenesis by Slit2Robo signaling and inhibition of

35、cancer growth by blocking Robo activityJ. Cancer Cell, 2003, 4(1):1929. 4 Mattern J, Koomagi R, Volm M. Biological characterization of subgroup s of squamous cell lung carcinomasJ. Clin Cancer Res, 1999, 5(6):14591463. 5 Maeda K, Chung Y S, Ogana Y， et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinomaJ. Cancer, 1996, 77(5):858863. 6 Chédotal A. Slits and their receptorsJ. Adv Exp Med Biol, 2007, 621:6580. 7 Morlot C, Thielens NM, Ravelli RB,et al. Structural insights into the SlitRobo complexJ. Proc Natl Acad Sc