W2101-微生物检验样品的采集-4-微教材

1、农产品/食品微生物检验课程-微教材微课名称微生物检验样品的采集关键词微生物检验；样品；采样原则；采样方案；采样方法微课类型讲授型微课形式PPT动画式教学设计模式讲授法教学目标掌握微生物样品采集的原则掌握微生物检验样品的采样方案了解微生物检验样品的采样方法教学内容知识点技能点微生物检验的一般步骤和检验的特点微生物检验样品的采样原则微生物检验样品的采样方案微生物检验样品的采样方法微生物检验样品的其他环节微生物检验样品的采样方案微生物检验样品的采样方法知识讲解微生物检验样品的采集 本次微课分成采样原则、采样方案、采样方法、其他环节几部分组成，下面分别进行介绍。引言食品微生物检验的一般步骤：样品采集（

2、填写采信标签） 样品保存和运输 收样 样品处理（检样） 开展检验 结果与报告可见，样品在送到检验室之前要先经历样品采集和运输环节。下面我们先来了解一下微生物检验样品采集的特点与要求。首先，我们来思考一个问题：要判断一锅汤的味道需要把整锅汤都喝完吗？答案当然是否定的，我们可以将锅里的汤“搅拌均匀”，品尝一小勺就知道汤的味道。这个简单的生活实例就代表了一种样品采集方法。 再来看微生物检验的特点 微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使

3、用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。 下面我们分别说明。一、采样原则根据GB 4789.12010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 微生物检验样品采集应该注意以下几个原则：1) 根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。2) 应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品具有代表性。3) 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。4) 样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。 从以上原则我们了解到微生物检验采样的关键词是代表性、无菌性以及保持样品状态，要达上这些要求我们需

4、要思考几个问题：即：采多少？ 即采样方案； 怎么采？ 即采样方法； 用什么采？ 即采样工具与准备要求 下面我们进一步分别说明二、采样方案目前的食品微生物检验采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，采样数量应适当增加，最低不少于8件。2.1 ICMSF 采样方案国际食品微生物标准委员会（The international Committee on Microbiological Specification for Foods，简称ICMSF）所建议的采样计划是目前世界各国在食品微生物工作中常用的采样方案

5、。它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。 ICMSF采样方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、及m值，三级法则有n、c、m及M值。其中：n：系指一批产品采样个数。c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。 我国国家标准GB 4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则也规定了微生物检验采样方案分为二级和三级。有关各类食品的

6、具体采样方案（即n、c、m及M值的确定），应按照相应产品标准中的规定执行。（1） 二级抽样方案。自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。（2）三级抽样方案。设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷

7、冻生虾的细菌数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌数是在m;M值之间，如果有3个以上检样的菌数是在m;M值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。（3）对ICMSF采样方案的理解。ICMSF把严格的采样计划与食品危害程度相联系。在中等或严重危害的（如致病菌）情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的（如卫生指标菌）则建议使用三级抽样方案。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1

8、加以说明。表1 ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类级别危害程度对象微生物食品经不同处理后的危害度减少（加热）无变化（冷冻品立刻进食）增加危害度（未加热吃到吃前还有一段时间）三级方案1. 食品的保藏细菌数例1n=5 c=3例2n=5 c=2例3n=5 c=12.轻度间接指标菌大肠菌群大肠杆菌金黄色葡萄球菌（指标菌）例4n=5 c=3例5n=5 c=2例6n=5 c=13.中度程度局部传播金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌产气荚膜梭菌例7n=7 c=2例8n=5 c=1 例9n=10 c=1 二级方案4.中度程度广泛传播沙门氏菌副溶血性弧菌致病性大肠杆菌例10n=5 c=0例11n=10 c

9、=0例12n=20 c=35.严重程度肉毒梭菌霍乱弧菌伤寒沙门氏菌副伤寒沙门氏菌例13n=15 c=0例14n=30 c=10例15n=60 c=0 注：表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。根据上表15种情况的举例，1-3可用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。在1-9例种检样需采5个（n=5），按照食品危害度污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法

10、判定。ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表2。为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌数限量是相同的，但情况有所不同，分别适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。表2 ICMSF虾的微生物标准食品名称检查项目例级别nc菌数限量/gmM冷冻生虾（加热吃，危害减少）细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌14410333255553330106410310210

11、74002103冷冻烹调虾（直接吃，危害增加）细菌数大肠菌群金黄色葡萄球菌副溶血性弧菌36912333255551110106410310210740021032.2 随机采样方案利用随机数表、随机数骰子或计算机产生的随机数进行抽样，叫随机数表法。先介绍随机数表法。怎样利用随机数表产生样本呢？下面通过例子来说明，假设我们要考察某公司生产的500克袋装牛奶的质量是否达标，现从800袋牛奶中抽取60袋进行检验，利用随机数表抽取样本时，可以按照下面的步骤进行。第一步，先将800袋牛奶编号，可以编为000，001，799。第二步，在随机数表中任选一个数，例如选出第8行第7列的数7（为了便于说明，下面摘

12、取了附表1的第6行至第10行）。 第三步，从选定的数7开始向右读（读数的方向也可以是向左、向上、向下等），得到一个三位数785，由于785799，说明号码785在总体内，将它取出；继续向右读，得到916，由于916799，将它去掉，按照这种方法继续向右读，又取出567，199，507，依次下去，直到样本的60个号码全部取出，这样我们就得到一个容量为60的样本。 【说明】随机数表法的步骤：1）将总体的个体编号。2）在随机数表中选择开始数字。3）读数获取样本号码。再介绍计算机产生的随机数法利用excel 自带的公式 randbetween(1,X)进行采样随机数产生。三、采样方法确定了采样方案以后

13、，采样方法对采样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。采样必须遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。3.1采样范围食品微生物检验包括以下采样点：原料、生产线（半成品、环境）、成品、库存样品、零售商店或批发市场、进品或出口口岸、种养殖场。原料：生产所用的原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等； 生产线：食品生产过程中不同加工环节所取的样品，包括半成品、加工台面、与被加工食品接触的仪器面以及操作器具等。对生产线样品的采样能够确定微生物污染来源，可用于食品加工企业对产品加工过程卫生状况的了解和控制，同时能够用于特定产品生产环节中关

14、键控制点的确定的HACCP的验证工作。另外，可以配合生产加，在生产前后或生产过程中对环境样品（如地面、墙壁、天花板及空气等）进行抽样检验，以了解加工环境的卫生状况。库存样品：测定产品在保质期内微生物种群以及数量的变化情况，同时也可以间接对产品的保质期是否合理进行验证。零售商店或批发市场：反映产品在流通过程中微生物变化情况，能够对改进产品的加工工艺起到反馈作用。进品或出口样品：按照进出口商品所签订的合同进行抽样和检测。要注意的是，除了满足合同外，还要满足进口国的相关法律规定。3.2采样方法3.2.1预包装食品对于即食类预包装食品，采取相同批次的最小零售原包装，即直接食用的小包装食品，尽可能取原包

15、装，直到检验前不要开封，以防污染。对于非即食类预包装食品l 原包装小于500g的固体食品或小于500mL的液态食品，取相同批次的最小零售原包装; l 原包装大于500mL的液态食品，采样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位（一般25mL）的样品；l 原包装大于500g的固体食品，每份样品应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一个灭菌容器内；3.2.2散装食品或现场制作食品1）液体样品通常情况下，液态产品较容易获得代表性样品。液态产品（如牛奶、奶昔、糖浆）一般盛放在大罐中。取样时，可连续或间歇搅拌（可使用灭菌的长柄勺

16、搅拌）。对于较小的容器，可在取样前将液体上下颠倒，使其完全混匀。较大的样品(100500mL)要放在已灭菌的容器中送往实验室，实验室在取样检测之前应将液体再彻底混匀一次。对于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用长形吸管）按不同深度分层抽样，并混匀。如样品含有固体悬浮物或不均匀液体，应充分搅匀后，方可采样。2）固体样品依所抽样品材料不同，所使用的工具也不同。固态样品常用的取样工具有灭菌的解剖刀、勺子、软木钻、锯子和钳子等。面粉或奶粉等易于混匀的食品，其成品质量均匀、稳定，可以抽取小样品检测(如100 g)。但散装样品就必须从多个点取样，且每个样品都要单独处理，在检测前彻底混匀，并从中取一份

17、样品进行检测。肉类、鱼类的食品既要在表皮取样叉要在深层取样。深层取样时要小心不要被表面污染。有些食品，如鲜肉或熟肉可用灭菌的解剖刀或钳子取样；冷冻食品可在未解冻的状态下可用锯子、木钻或电钻(一般斜角钻人)等获取深层取样样品；全蛋粉等粉末状样品取样时，可用灭菌的取样器斜角插入箱底，样品填满取样器后提出箱外，再用灭菌小勺从上、中、下部位取样。3.2.3表面取样通过惰性载体可以将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物检验，这种惰性载体既不能引起微生物死亡，也不应使其增殖。这样的载体包括清水、拭子、胶带等。取样后，要使微生物长期保存在载体上，既不死亡又不增殖十分困难，所以应尽早地将微生物转接

18、到适当的培养基中。转移前耽误的时间越长，品质评价的可靠性就越差。表面取样技术只能直接转移菌体，不能做系列稀释，只有在菌体数量较多时才适用。其最大优点是检测时不破坏样品。下面介绍两种主要的表面取样法：拭子法：进行定量检测时，必须先用灭菌采样框（塑料或不锈钢等）确定被测试的区域。采样时先将拭子在稀释液中浸湿，然后在待测样品的表面缓慢转拭子，平行用力涂抹两次。涂抹的过程中应保证拭子在采样框内。采样结束后拭子放至装有10mL采样溶液的试管中。淋洗法：用十倍于样品的灭菌稀释液（质量比）对样品进行淋洗，得到10-1的样品原液。这种采样方法可用于全禽、干果、蔬菜等。报告结果时应注明该结果仅代表样品表面的细菌

19、总数。3.2.4空气样品空气的取样方法有直接沉降法和过滤法。在检验空气中细菌含量的各种沉降法中，平皿法是最早的方法之一，到目前为止，这种方法在判断空气中浮游微生物分次自沉现象方面仍具有一定的意义。平皿法就是将琼脂平板或血琼脂平板放到空气中暴露一定时间，然后36培养48h，计算所出现的菌落数。过滤法是使定量的空气通过吸收剂，然后将吸收剂培养，计算出菌落数。简要操作如下：使空气通过盛有定量无菌生理盐水及玻璃珠的三角瓶。液体能够阻挡空气中的尘粒通过，并吸收附着其上的细菌，通过空气时需振荡玻璃杯数次，使得细菌充分分散于液体内，然后将此生理盐水1mL接种至琼脂培养基，在36培养48h，计算所出现的菌落数

20、。3.2.5生产过程中的采样生产过程中的样品一般是指原材料，原料生产用水、包装材料或其他任何使用的生产线的材料，所采样品一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工工序中的某些地方。划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性；如用固定在贮液桶或流水作业线上的抽样龙头抽样时，应事先将龙头消毒；当用自动抽样器取不需要冷却的粉状或固定食品时，必须履行相应的管理办法，保证产品的代表性不被人为地破坏。3.2.6水样的采取取水样时，最好选用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。对于用氯气处理过的水，采样前在每500mL的水样中加入2mL的1.5%的硫代硫酸钠溶液。在取自来水时，水龙头嘴的里外都应擦干净。再用酒精灯灼烧水

21、龙头灭菌，然后把水龙头完全打开，放水5min10min后再将水龙头关小，采集水样。但是如果检测的目的是为了追踪微生物的污染源的，建议还应在龙头灭菌之前取水样或在龙头的里边和外边用棉拭子涂抹采样，以检测龙头自身污染的可能性。从水库、池塘、井水、河流等取水样时，用无菌的器械或工具拿取瓶子和打开瓶塞。采样时，先将无菌采样器浸入水下1cm15cm处，井水在水下50cm深处，然后掀起瓶塞采集水样。流动水区应分别采取靠岸边及水流中心的水。最后，提几点注意事项：1) 取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；2) 如为非冷藏易腐食

22、品，应迅速将所抽样品冷却至0-4；3) 不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖；4) 冷冻食品采样后在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。3.3采样工具与准备工作微生物检验所用采样工具要达到无菌的要求。因此，应根据不同的样品特征和采样环境，对采样物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。对采样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌。1）开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包裹灭菌（121 ，15min），干燥洁净的环境中保存2个月。2）样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、刀子、剪子、压舌板、木（电）钻、打孔器、金属

23、试管和拭子等。3）取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金属试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中易碎。4）温度计：-20 100 ，温度间隔1 。最好使用金属或电子温度计。使用前在70%75%乙醇溶液或次氯酸钠（浓度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。5)消毒剂： 70%75%乙醇溶液、中等浓度（100mg/L）次氯酸钠溶液等。6）标记工具：标签纸（不干胶标签纸）、油性或不可擦拭记号笔。7）样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。8）天平：最大量程为2000g，感量为0.1g。9）搅拌器和混合器：必要时配备带有灭菌罐的搅拌器或混合器。10）稀释液：灭菌的磷酸盐

24、缓冲液、0.1%蛋白胨水、生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、LB肉汤等。11）防护用品：对样品的防护，即保护生产环境、原料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染。主要包括工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。均需事先消毒灭菌（或使用一次性无菌物品)。四、其他环节4.1包装密封为保证样品的完整性，装有样品的包装物应进行封口，以证实其可靠性，即从取样地点至实验室这段时间不发生任何变化。可采用自粘胶、特制的纸黏着剂或者石蜡等封口，封口处应留出填写日期、检验人员和货主签字的地方，然后盖上专用的印章。 4.2样品的标志取样过程中应对所取样品进行及时、准确的标记。取样结束后，应由取样人写

25、出完整的取样报告。样品应尽可能在原有状态下迅速运送或发送到实验室。保存的样品应进行必要的清晰的标记，内容包括：样品名称，样品描述，样品批号，企业名称，地址，取样人，取样时间，取样地点，取样温度(必要时)，测试目的等。标记应牢固并具防水性，确保字迹不会被擦掉或脱色。所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。当样品需要托运或由非专职取样人员运送时，必须封死样品容器。 4.3样品的运输取样结束后应尽快将样品送往实验室检验。如不能及时运送，冷冻样品应存放在-15以下的冰箱或冷库内；冷藏和易腐食品存放在04 冰箱或冷藏库内；其他食品可放在常温暗处

26、。样品的运输过程必须有适当的保护措施(如密封、冷藏等)，以保证样品的微生物指标不发生变化。运送冷冻和易腐样品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂，但样品不可与冷却剂或冷冻剂直接接触，保证途中样品不升温或不融化，必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又回流瓶内，从而增加污染。如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字样。做好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。 4.4. 样品的接收在接收样品时，实验室应与送样人共同相互确认样品与委托单上的内容是否一致。确认内容一般包括：品名；检验目的；检验项目；形状和包装状况(固体、粉状、冷冻、冷藏、零售、批发、无菌包装等都不同)；抽样数量(个数和质量)；抽样日期及送达日期；抽样地点；随货样附带的许可申请单编号；生