细胞计数的标准化

1、对自动化血细胞计数和白细胞分类后手工检查标准的建议hzdlj(译)摘要：自第一台自动化血球仪问世的半个世纪以来，手工技术，尤其是显微镜下观察染色血片的技术，补充了血球仪检测结果，使病人的血液标本结果全面。多年以来，随着血球仪性能和技术的不断改进，自动化血球仪和手工补充手段的角色正在改变，自动化血球仪结果后的手工操作（重要是手工涂片分析），主要决定于其是否符合一系列复查标准中的一条来。在各个实验室之间还没有统一的行为标准。从长远出发，需要指定一定普遍能够接受的规则，用于血球仪分析后复查细胞计数和分类。Berend Houwen博士于2002年邀请了20名专家在spring开会，商讨规则细节，决定

2、最恰当的标准。在这次会议上，一致通过了83条规则。15个实验室以13298例血液标本对这些规进行了测试。并对数据进行详细的分析，这些规则被重新定义，合并成了本文的41条规则。包括适用于首次检查的规则，同一个病人72小时内重新检查的差值规则。希望这些规则对于世界范围的大多数血液学实验室有用。各个实验室在将本规则贯彻于病人标本之前，应证实这些规则的有效性，本文也包含了一些用于验证的建议条款。关键词：血细胞，一致，差值，图象介绍：人类血细胞的分析可以追溯到330年前，列文胡克第一个通过自制的由微小显微镜构成的简单的显微镜描述了红细胞，他甚至可以通过显微镜测量红细胞的直径。复合显微镜的发展使得人们可以

3、对白细胞、红细胞、血小板进行更为全面的描述，同时检测技术的发展使得可以在规定的体积内对其进行计数。直到Paul Ehrlich通过用苯胺染料(aniline dyes)对血细胞进行染色，可以区分细胞核、细胞浆以及一些完好的细胞结构，细胞的世界才变得五颜六色。他把各种不同的白色的细胞（white cells）划分为五种类型，也就是今天仍然沿用的分类标准。在20世纪前半叶，通过手工操作在固定体积的容器里对白细胞，红细胞，血小板进行计数；手工血红蛋白检测以及PCV检测等，在临床上广泛应用。这些几乎都是一成不变地伴随着显微镜对染色的血片进行白细胞分类，以及评估红细胞和血小板的大小和体积进行评价。195

4、6年，Wallacc Coulter发明了第一台自动化血球仪，用于对血细胞进行计数以及体积描述。这是一个单通道的装置，克服了手工细胞计数繁琐且不精确的缺点。60年代，发展了多参数的血细胞计数分析仪；70年代，两种技术在白细胞的分类计数中相互竞争。其一是图像分析技术（image analysis technology），试图模仿人工显微镜检检查，由于存在很多局限性，因此并没有发展下去；第二种技术就是应用细胞化学技术，在自动血球仪上通过“流式（flow）”的方法在不同的计数池对细胞进行识别，WBC分类也是通过“流式”不同的方法对细胞进行辨别，此项技术随后发展了起来。80年代，血细胞计数和WBC分类

5、技术融合进入同一平台，产生了当前广泛使用的多参数“流式”血细胞计数和分类的血球仪，许多制造商都可以提供。图象工具也应用运用到这些血球仪以提醒操作者异常细胞形态的存在以及出现了血球仪不能计数的异常细胞等，同时还可以提示标本的某些特征，比如血小板聚集，其可以导致不正确结果的产生。自第一台自动化血球仪问世以来，手工技术，特别是显微镜对染色血片进行观察，补充上血球仪的结果，能为病人血液标本提供了更为广泛的报告。近年来，由于血球仪的性能和技术不断改进，血球仪的角色以及弥补的过程已经发生了改变。我们认识到自动血球仪在WBC、RBC、PLT计数以及形态较好的成熟WBC分类中更胜一筹，而显微镜检基于细胞学特征

6、的微小变化，在区分细胞，尤其是不成熟细胞中更具有优势。对于很多标本，已经没有必要进行显微镜检或者手工分类计数了。最近，由于控制成本的压力，以及缺乏训练有素的工作人员，都逐渐需要在不牺牲结果质量的前提下，减少手工检查的数量。因为主要的补充程序是显微镜涂片镜检，决定每个标本是否有涂片镜检的必要性，对于血液学实验室成本中、工作量、以及出报告的速度都起着重要作用。人工涂片检查为我们提供额外的或者血球仪漏掉的信息，或者用于验证血球仪结果。显微镜检通常是根据适用于血球仪结果的涂片镜检标准来执行的。每个实验室都制定了自己的血球仪检测后的工作标准。目的就是减少需要动手（通常是涂片镜检）的标本的数量到最大程度，

7、同时不至于因为错误的或者易误导的报告，尤其是假阴性的结果而损害病人。尽管如此，单个实验室几乎没有机会知道自己执行的标准对于减少假阳性，假阴性是否是最恰当的。非正式的信息交换显示，不同实验室之间的涂片镜检率从5%到95%不等。这是不能完全用病种的不同以及仪器的不同来解释的。Berend Houwen博士认识到，从长远来看，需要制定一个普遍能接受的标准，用于血球分析仪分析后复查血细胞计数以及分类。他邀请了20名专家于2002年在spring商讨这个话题，并且在大多数恰当的标准上达成了共识。要邀请来的血液学学者代表了6个国家17个实验室，在复查标准上一流的专家。这些实验室包括三级医院（servici

8、ng tertiary hospitals），肿瘤医院，社区医院，儿童医院和私立医院(doctors office)(见附录1)。在近三天的时间里，血细胞计数的每一个参数都进行了深入的讨论，并达成了一致的意见，即在什么情况下复查启动对自动分析仪分析结果的复查，大概包含进一步的测试或者涂片复查。来自15个实验室的代表同意按照随后会议制定的细则，在他们各自的实验室对这些规则进行测试。对规则验证以及发展情况，包括各自对补充临床血液学实验室的补充建议，都包含在本文中。材料合方法：为验证这些规则的合理性，每个实验室被要求做1000个标本。这些标本是从一段时间的日常标本里面随机挑选出来的，代表了实验室的病

9、种分布。在这1000个标本中，有800个是首检标本，用于测试关于首检标本的规则。剩下的200个标本是二次检测标本，用于测试关于二次检测标本的规则。每个实验室都按照自己的标准操作规程（SOP）在本室的血球仪上对标本进行检测。此外，不管SOP文件要求是否对检测标本进行涂片镜检，对所有的标本都进行涂片染色观察。并在实验中对所有的病人的标本进行手工涂片分类。如果涂片分类是日常工作中要求的，其结果也被纳入研究。所有的数据都上交给指导委员会（steering committee）进行分析。每个成员所提交的数据是一张电子表格，包含了每个标本的识别，执行的每条规则情况，涂片镜检，仪器图象（instrument

10、 flag），所有血细胞计数的结果，按本实验室规则是否需要对标本进行涂片检查，样本差值（sample delta），以及每个重要发现的评价。数据由指导委员会成员进行细致的分析和回顾。指导委员会对数据进行初步评估后，很明显：并不是所有的实验室都使用相同的标准来定义什么是不正常的涂片结果（阳性发现）。指导委员会制定了一系列单独的标准，并将其重新应用于原始数据中。表1包含了协作组依据临床相关性而用来定义涂片阳性（异常发现）的标准。先对所有实验室的数据进行单独分析，然后再将所有实验室数据汇总分析。指导委员会对所有的数据进行回顾，比较使用各条规则对外周血进行涂片镜检时的观察结果。如果符合某条规则，并且镜

11、检也有阳性发现，那么这个标本就本定义为真阳性；如果符合某条规则，但是镜检并没有阳性发现，那么这个标本就本定义为假阳性；如果不符合某条规则，但是涂片时有阳性发现，则该标本被定义为假阴性；如果不符合某条规则，涂片也无阳性发现，则被定义为真阴性。将正确率表格(truth table)发放给各个实验室，然后将来自所有实验室的数据汇总到表2。结果：因某些实验室没有能够达到1000个标本的要求，故协作组（consensus group）共提交了13298个病人的分析数据。参加协作的单位的血球仪包括：Abbott CellDyn 4000, Bayer ADVIA 120, Beckman Coulter

12、Gens及LH750, Sysmex se-9000及XE2100。虽然各个实验室的设备和仪器不同，但是为各个实验室准备的准确率表格都是相同的，所有样本总的正确率结果见表2。最终的关于关于自动化血球仪血细胞计数和分类后复查的规则4共有1条，见表3。该表列举了每个参数复查的标准以及进一步的操作建议。列举出来的规则有针对初次检查的标本，也有针对二次检查的标本。关于“差值规则（delta rules）”一词的定义见表4。在41条规则中，15条规则和血细胞计数有关；7条规则是关于5种白细胞的分类参数的；7条是关于仪器可疑的图象或者代码的（包括红细胞和血小板）；10条是关于白细胞可疑的图象或者代码的，2

13、条是和网织红细胞有关的。讨论数据分析表明：虽然本研究使用了来自不同实验室的品牌各不相同的血球仪，但是所有的实验室都有相似的正确率表格。这对于假阴性范围的统计是十分重要的。指导委员会意识到制定一个良好的复查标准，以在涂片上找到阳性结果，对于制定正确率表格来说是十分重要的。为了让这些标准更客观，更有意义，我们将涂片镜检与其临床意义联系起来考虑。显然，将所有的不异常发现都标记上是不恰当的，如大血小板，偶见细胞破裂（occasional schistocyte），轻微的细胞分布不均或者细胞不规则(slight anisocytosis and poikilocytosis)等可能的异常发现。我们制定了

14、一系列在我们看来是临床意义很大的镜检发现（见表一）。使用达成共识的规则（consensus rules），各个实验室总的假阴性率只有2.9%（386/13298）。而使用各个实验室自己的标准，假阴性率也只有3.8%（503/13298）。所以达成共识的规则的假阴性率和各个实验室的规则比起来，似乎没有多少改进。重要的是我们认识到各个实验室已经在使用共识规则里的某些条款了。假阴性率的推导和计算见表5。18.6%的假阳性率和各个实验室的规则比起来也相似。假阳性率主要是通过各个仪器的图形判断的。这可以通过本研究所采用的仪器得出来，这些仪器也代表了目前广泛应用于血液学实验室的多参数的血细胞分析仪。这些仪

15、器作为一个粗筛的设备，通过图形对异常的标本做进一步的复查。为了避免漏掉一些潜在的重要的异常发现，减少假阴性率，这些仪器在设计可以图象的符合标准时都有较高的假阳性率。在数据分析完成之后，对这些规则进行回顾，分析哪些规则较容易出现以及他们出现的频率。我们发现有3条规则在13298例标本中都没有出现过。正因如此，很有可能他们在血球仪的日常工作中出现的几率就不高。此外，联系到临床意义，我们认为不管是在研究中还是在临床实践中，其意义不大，所以这些规则被去掉了。我们通过结合“相同参数（like parameter）”个人的理解可能是仪器提示PLT聚集），不论计数，首先应该检查标本有无凝块，其次应该涂片镜检

16、估计PLT计数，如果继续聚集，执行实验室SOP。31，血小板直方图异常（血小板聚集引起的除外），应该涂片镜检。32，有不成熟粒细胞（仪器图像判断），且为首次检查时，应该涂片镜检。33，有不成熟粒细胞（仪器图像判断），34，有核左移的图像（仪器图像判断或者提示），应该执行实验室SOP。35，有异型（变异）淋巴细胞图像（仪器提示有异淋），且为首次检查时，应该涂片镜检。36，有异型（变异）淋巴细胞图像（仪器提示有异淋），以前证实过结果，但是WBC阳性差值失败，应该涂片镜检（希望专家能解释一下本条规则-译者）。37，有原始细胞图像（仪器提示有原始细胞），且为首次检查时，应该涂片镜检。38，有原始细胞图像（仪器提