血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的作用

1、血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的作用         06-07-01 10:17:00     作者：苏华，朱忠华，邓安国    编辑：studa20 【摘要】  目的  研究血管内皮生长因子（VEGF）在先兆子痫大鼠肾损伤中的作用。方法  采用一氧化氮合酶抑制剂复制大鼠先兆子痫模型，通过双抗酶联免疫吸附法检测血浆及尿液中VEGF含量，应用原位杂交法测定肾小球VEGFmRNA转录水平，利

2、用免疫组化法检测肾小球VEGF蛋白表达情况。结果  在先兆子痫大鼠中，尿液中VEGF含量（以尿VEGF/尿肌酐表示）升高且与肾脏局部VEGF的表达强度呈正相关，肾小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表达均增强，且表达的强度与24h尿蛋白排泄量呈正相关。结论  尿液VEGF可能来源于肾脏局部的分泌，肾小球VEGF可能参与了先兆子痫中大量蛋白尿的产生。        【关键词】  血管内皮生长因子；先兆子痫；蛋白尿        【Abs

3、tract】  Objective  To investigate the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF) in kidney lesion of rats with preeclampsia.Methods  A rat model of preeclampsia was developed by inhibitor of nitric oxide synthase. Plasma and urinary VEGF were determined using a sandwich enzyme

4、 immunoassay. The level of VEGFmRNA in glomeruli was measured by in situ hybridization. The expression of VEGF protein in glomeruli was detected by immunohistochemistry method.Results  In rats with preeclampsia， urinary VEGF levels (expressed as VEGF/creatinine ratio) were significantly higher

5、and positively correlated to the expression of VEGF in glomeruli， the level of VEGF mRNA and the expression of VEGF were significantly higher than other groups. There was a positive correlation between the expression of VEGF in glomeruli and 24 h urinary protein excretion.Conclusion  Corrected

6、urinary VEGF levels can stand for the expression of VEGF in glomeruli. VEGF in glomeruli might be involved in the mechanism of proteinuria in preeclampsia.        【Key words】  vascular endothelial growth factor； preeclampsia； proteinuria     

7、60;  先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因，肾脏损伤所致的大量蛋白尿为其主要的临床表现。引起肾小球滤过膜通透性增高的原因目前不详。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种强效的增强血管壁通透性的生物活性物质1。有研究表明血浆及胎盘蜕膜局部VEGF水平的改变可能与妊高征的发病有关。但血浆、尿液VEGF水平与肾脏局部VEGF表达的关系及肾脏局部VEGF的表达与先兆子痫肾损伤的关系至今国内外尚未有研究。本试验拟通过一氧化氮合酶抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro-arginine，L-NAME）复制大鼠先兆子痫

8、模型2，检测血浆、尿液中VEGF浓度，观察肾小球中VEGF的表达及其表达的强弱与24h尿蛋白排泄量的关系，从而探讨VEGF在先兆子痫肾损伤中的作用。        1  材料与方法        1.1  主要试剂与仪器  L-NAME（美国Sigma公司），VEGF Elisa试剂盒（北京中山生物有限公司），地高辛标记的VEGFmRNA探针（德国Biognostik公司），VEGF多克隆抗体（Santa Cruz公司），SABC试剂盒（武汉博士

9、德生物制品公司），大鼠尾动脉袖带式血压计（由同济医学院心血管研究中心提供），透射电镜（由同济医学院超微病理学教研室提供），计算机病理图像分析仪（由同济医学院清屏影像公司提供）。        1.2  动物模型复制与分组  取200250g普通级Wistar雄性大鼠50只和成年Wistar雄性大鼠25只（由同济医学院实验动物学部提供），按雌：雄=2：1比例同笼混合饲养一夜后，次日清晨当雌性大鼠阴道涂片检查可见活动的精子时，确认为大鼠妊娠第1d。将孕鼠随机分为两组，A组：先兆子痫模型组（n=6），B组：正常妊娠对照组

10、（n=6）。另取6只无妊娠史雌性大鼠作为C组，即未孕L-NAME处理组。从妊娠第18d开始对A组和B组大鼠分别皮下注射L-NAME和蒸馏水250mg/（kg·d），持续4d后于妊娠第22d时处死。C组大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/（kg·d），持续4d后处死。        1.3  24h尿蛋白排泄量的测定  用标准代谢笼分别与注射前和注射第2、4d收集各组大鼠24h尿液，采用考马斯亮蓝结合法测定24h尿蛋白排泄量。      

11、60; 1.4  收缩期血压的测定  A组和C组大鼠于L-NAME注射前及L-NAME注射第2、3、4d测量尾动脉收缩压。具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至3840，待其安静后用大鼠尾动脉血压仪在5min内连续测量3次收缩期血压，取平均值。        1.5  血浆及尿液标本的采集与检测  在注射第4天时经眼静脉窦采集各组大鼠静脉血2ml，置于经肝素抗凝的玻璃管，3000r/min离心10min后取上清液，置于-70冰箱保存待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各组大鼠尿液，3000r/min离心1

12、0min取上清3ml存放于-70冰箱保存待检。采用双抗酶联免疫吸附法（ELISA），通过绘制标准曲线求出标本VEGF的浓度，为了纠正尿液浓度不同的影响，尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐（ng/mmol Cr）来表达。        1.6  原位杂交法  大鼠处死后，取一侧肾组织将其置于4%多聚甲醛液12h、脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片后，具体操作步骤按VEGFmRNA 原位杂交试剂盒说明书进行。实验设不加探针的阴性对照。显微镜下胞浆呈黄色颗粒状为阳性。     &#

13、160;  1.7  免疫组织化学法  VEGF蛋白用免疫组织化学法检测，具体操作步骤见试剂盒说明书。实验均设不加一抗的阴性对照。显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒状者为阳性，蛋白表达强弱用吸光度（absorbance，A）表示。每张切片随机选取5个肾小球，用免疫组化分析软件（HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统）计算VEGF阳性着色细胞吸光度。        1.8  统计学方法  实验数据以x±s表示，组间数据差异的显著性分析，方差齐者采用t检验，方差不齐时采用t检

14、验。        2  结果        2.1  24h尿蛋白排泄量  A组大鼠L-NAME注射第2d时24h尿蛋白排泄量（35.16±11.31）mg/24h较注射前（4.52±1.00）mg/24h增高，注射第4d时24h尿蛋白排泄量（55.41±20.25）mg/24h更高，P均<0.01。注射前各组大鼠24h尿蛋白排泄量间无统计学差异（P0.05）。注射后，同一时间段内，A组大鼠24h尿蛋白排泄量

15、较B组（P<0.01）及C组（P<0.01）有显著性增高，见表1。 表1  各组大鼠24h尿蛋白排泄量 (x±s，n=6，mg/24h)注：与A组比较*P<0.01，与注射前比较P<0.01    2.2  收缩期血压  A组和C组大鼠注射L-NAME后，血压进行性上升。注射前两组大鼠血压间无统计学差异（P0.05）。注射L-NAME后，同一时间点上，A组大鼠血压明显高于C组，两组间有显著的统计学差异（P<0.01），见表2。表2  A组和C组大鼠收缩期血压  （x±s，n=6，mmHg）注：与C组比较*P<0.01    2.3  血浆、尿