水产品中致病性副溶血性弧菌的检测

1、重庆医科大学硕士学位论文水产品中致病性副溶血性弧菌的检测姓名：王宏萍申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：鲍依稀;周晓明20090501水产品中致病性副溶血性弧菌的检测摘要副溶血性弧菌是食物中毒的重要病原菌。环境中的副溶血性弧菌为非致病菌，为致病菌。判断水产品的食用合格性需要准确鉴定的致病菌。神奈川溶血反应曾作为致病性判定的标准，但该试验操作繁琐，易产生假阳性。耐热性溶血毒素作为副溶血性弧菌致病性的主要毒力因子，可由基因的检出来判断菌株的致病性。该方法尚未在国内进行应用。本研究建立了一个以序列分析鉴定副溶血性弧菌，以基因测定的和实时荧光定量反应体系定量反映副溶血性弧菌致病性的方法，并

2、与神奈川溶血反应，脲酶反应进行比较。使用分析临床分离的株常见菌作为对照，对株副溶血性弧菌进行测定；株副溶血性弧菌的鉴定结果与生化培养法相符，对临床分离菌株均无误判。对株腹泻患者来源和株环境来源分离的副溶血性弧菌进行基因测定，神奈川溶血反应和脲酶反应。腹泻患者和环境来源菌株的基因检出率有显著差异（，）。神奈川溶血反应和脲酶反应的区分能力低于基因检测。建立了一个实时荧光定量反应以测定基因拷贝水平，定量公式为（，）。关键词：副溶血生弧菌，序列分析，基因，实时荧定量，神奈川溶血反应资助渠道：本课题受上海市科委技术标准专项资助以及上海申康医院发展中心病原体检测技术平台资助，口厂口办口”纱纪“（），重庆医

3、科大学硕士研究生学位论文，（）（，沪）：，重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写冲符号说明英文全称中文全称核糖体核糖体碱性蛋白胨水改良的培养基腹泻性贝毒中毒翅甲藻毒素酶联免疫吸附试验神奈川现象长距离精确培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应实时荧光定量反向胶乳凝集试验社会科学统计软件包硫代硫酸盐枸橼酸盐胆汁酸盐蔗糖琼脂耐热性溶血毒素不耐热溶血毒素耐热性溶血毒素相关溶血毒素副溶血性弧菌重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科

4、大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意，申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任学位论文作者签名：每避二期：号乏嗥一学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，印：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果对署名单位为重庆医科大学，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全都或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：丝益

5、指导教师签名：日期：重庆医科大学硕士研究生学位论文水产品中致病性副溶血性弧菌的检测前言水产品是人类生活重要的食物来源之一。本文所指的水产品主要包括鱼，贝类，甲壳类等动物性水产品。我国每年经上海口岸进出口的水产品约万吨，总值约亿美元，全国每年水产品消费额超过亿元人民币【。水产品的主要卫生问题是细菌污染和细菌毒素残留导致的食用者胃肠炎或食物中毒。我国细菌性食物中毒的首要病原菌为副溶血性弧菌（，）。在上海，副溶血性弧菌在细菌性食物中毒事件中的分离率为【，。副溶血性弧菌也是引起日本，美国，欧洲以及东南亚等沿海国家和地区食源性疾病的常见病原茵。我国曾经强制要求将副溶血性弧菌的检测作为水产品质量的检测标准

6、（，）。国际微生物标准委员会和日本，英国，加拿大等国及我国香港地区都提出对水产品开展副溶血性弧茵的检测工作。副溶血性弧菌广泛生存于近海岸的海水，海底沉积物和鱼虾类，贝类及盐渍加工的水产品中。我国华东沿海水产品中副溶血性弧菌的检出率为，夏季高达【】。腌制鱼贝类的带菌率达（：）。根据致病性可将副溶血性弧菌分为致病菌和非致病菌。然而，自然环境和水产品中分离得到的大多数副溶血性弧菌都无致病性，为致病菌【】。这个比例可因季节，地理位置或样本类型的不同而有所浮动。所以，副溶血性弧茵的检出与水产品是否可以安全使用并不完全相符。仅根据副溶血性弧菌的检出作为水产品安全的控制标准，将无法进行水产品的正常进出口贸易

7、。关键是要准确鉴定出致病性副溶血性弧菌，对于有效控制我国口岸水产品质量，保障社会消费水产品的卫生标准是项重要工作。传统的分离鉴定细菌的方法主要是生化表型鉴定法。这种方法耗时较长（天）【】，由于细菌的生化代谢型经常随环境条件的差异而有很大差异，因此，很多细重庆医科大学硕士研究生学位论文菌种类可能难以鉴定。核糖体（）是细菌分型鉴定可用的标志物之一，常使用基因序列的差异进行分型。是细菌染色体上编码相对应的序列，该基因序列全长约，由可变区和保守区交替组成，包含一定的种间多态性网。能通过测序技术快速得到核酸序列，是理想的基因鉴定靶序列。此外，大肠埃希茵，志贺氏茵，葡萄球菌，普通变形杆菌等也是食源性传播可

8、引起腹泻或食物中毒的细菌，其腹泻患者的炎症反应与副溶血性弧菌感染菌者相似。因此，准确检测水产品中的副溶血性弧菌需要与这些混杂细菌区分开。大多数临床来源和少数环境或水产品来源的副溶血性弧菌在我萋培养基（）上培养、时后菌落周围可呈现出清晰透明的一溶血环，称为神奈川现象（，）。曾使用神奈川溶血反应将副溶血性弧菌分为致病性和非致病性菌株。但是神奈川反应操作繁琐，在多种实践环境中反应不典型，不易判断结果【】，不适合口岸检疫或临床实验室常规工作的需求。神奈川现象可由耐热性溶血毒素（，）弓起【，因此认为是副溶血性弧菌主要的毒力因子。一些研究发现有的致病性副溶血性弧茵为阴性，但这些菌株中可检测到耐热性溶血毒素

9、相关溶血毒素（，）】，认为是副溶血性弧菌的又一致病因子。和分别由和砌编码【】，但是砌基因的检出率（）【，远小于基因（）【，】，因此，基因可能比砌基因更适宜作为判断致病性副溶血性弧菌的标志物。酶联免疫吸附试验（），免疫层析试验（）等免疫学方法已经用于副溶血性弧菌表达水平的检测，最低检出限分别为和。但是这些方法无法检测出环境或临床分离的因环境，代谢改变而暂无表达或表达量较低的致病性副溶血性弧菌【临引。虽然聚合酶链式反应（）可以检测砌基因，可用于区分致病性和非致病性副溶血性弧菌。但是不能测定基因的拷贝水平，难于对致病性进行定量分析。因此，我们希望建立一个以定量基因拷贝水平的实时荧光定量反应体系以定量

10、反映副溶血性弧菌的致病能力。综上所述，本研究希望建立一个序列分析方法用于副溶血性弧菌重庆医科大学硕士研究生学位论文菌株的准确鉴定：建立针对副溶血性弧菌致病因子的快速基因检测和定量检测方法，评价该方法与神奈川反应，脲酶反应的应用效果。以此数据为依据，应用于水产品安全性的常规检疫过程。重庆医科大学硕士研究生学位论文实验材料和方法材料菌株来源副溶血性弧茵：年月至年月之间分别从上海市金山区，浦东新区和舟山渔场的食物中毒和胃肠炎腹泻患者，水产品及陆地环境水，养殖用水样本中分离得到，由上海市出入境检验检疫局提供（表）。表副溶血性弧茵茵株来源将腹泻患者分离的副溶血性弧菌视为临床来源菌株，水产品和水样分离的菌

11、株视为环境来源菌株。临床分离菌株：年月至年月之间从上海市公共卫生临床中心检验科微生物实验室分离的临床常见菌株，经生化培养法鉴定为种共株（表）。重庆医科大学硕士研究生学位论文表临床分离生化培养鉴定茵株材料和试剂羊血琼脂平板（上海伊华医学科技有限公司）硫代硫酸盐枸橼酸盐胆汁酸盐蔗糖琼脂粉（）（上海市疾病预防控制中心试剂研究中心提供）液体培养基（公司）血琼脂基础培养基（上海市疾病预防控制中心试剂研究中心提供）尿素琼脂基础培养基（上海市疾病预防控制中心试剂研究中心提供）鉴定条（法国生物梅里埃公司），鉴定卡（法国生物梅里埃公司）柱式细菌基因组抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），缓冲液（含），

12、酶（，宝生物工程有限公司，大连）重庆医科大学硕士研究生学位论文引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）柱式胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），缓冲液（含），热启动酶（，宝生物工程有限公司，大连）探针合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）新鲜兔血（上海市出入境检验检疫局食品与动植物检验检疫中心提供）仪器药敏分析系统（法国生物梅里埃公司）小型全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司）血细胞计数板相差显微镜：（尼康公司）型落地式恒温摇床（公司）紫外分光仪（公司）仪：（公司）实时荧光定量仪：（公司）方法细菌复苏或培养鉴定取副溶血性弧茵的保存菌株在硫代硫酸盐枸橼酸盐胆汁酸盐一蔗糖琼脂

13、（，）平板划线，培养小时。临床分离菌株菌株经平板划线，培养小时后，革兰氏染色，观察细菌菌落形态和显微镜下细菌形态；使用鉴定条或，鉴定卡（药敏分析系统和小型全自动微生物鉴定系统，法国生物梅里埃公司）确定菌株的生化培养型。副溶血性弧菌值的测定和相差显微镜下绝对计数随机选择株不同的副溶血性弧菌在平板上形成的菌落，挑取适量，重庆医科大学硕士研究生学位论文接种于液体培养基。震荡培养，使细菌处于对数生长期。以空白液调零，测定茵液值。茵液经适度稀释，使用血细胞计数板在相差显微镜下进行绝对计数。神奈川溶血试验将副溶血性弧菌株接种于含的血琼脂基础培养基，培养小时，小时内观察结果。菌落周围呈现出清晰透明溶血环为阳

14、性结果，无溶血或非溶血为阴性结果。脲酶试验将副溶血性弧茵接种于含的尿素琼脂基础培养基，培养小时，观察结果。细菌基因组的定量提取从平板或血平板挑取适量菌落或将已测定值的菌液离心取沉淀物，混于溶液（，），使用柱式细菌基因组抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）依照操作说明提取细菌基因组。简述为依次加入裂解液和蛋白酶溶液，裂解细菌释放基因组，离心，取上清液加入。吸附柱，使用洗涤液去除杂质，用洗脱，获得细菌基因组，浓度约为。引物和探针设计和砌基因的普通聚合酶链式反应（）扩增引物分别根据文献【，合成。的引物正向序列为：，（参考序列：，位置在处）【】，反向序列为：（位置在处）】。基因的位置依据号为

15、的基因序列，正向引物为一（位置在处），反向引物为（位置在处）】。砌保守序列来源于条己报道的序列的序列（序列号分别为，￥，￥，￥和），根据保守区域殴计探针，序列为重庆医科大学硕士研究生学位论文（位置在处）。因上述扩增基因的引物与探针组合不能有效进行实时荧光定量反应，因此使用软件另行设计实时荧光定量适用的扩增引物，正向序列为一（位置在处），反向序列为（位置在。处），目的片段长度为。和基因扩增序列的扩增条件为反应体系，细菌基因组做模板，“正反向引物各，×缓冲液（含），酶（，宝生物工程有限公司，大连），补足体系。扩增条件为起始变性分钟；接着反应个循环（秒；秒；（分钟）；终末延伸分钟。以做空白

16、对照。产物取作琼脂糖凝胶电泳（，分钟）。基因的扩增使用的扩增引物为：正向引物，反向引物【。条件为“反应体系，模板使用细菌基因组，正反向引物各，山缓冲液（含），“酶（，宝生物工程有限公司，大连），补足体积。扩增条件为起始变性分钟；之后反应个循环（秒；秒；分钟）；终末延伸分钟。以做空白对照。产物取作琼脂糖凝胶电泳（，分钟）。扩增产物测序的产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序（测序试剂为，测序引物使用正向扩增引物。测序结果用校正后，在网站上（¨）进行比对。判断标准重庆医科大学硕士研究生学位论文结果中出现比对分值最高（具有数值）的细菌种类的比对结果确定为相应属种。定量基因标准模板的制

17、备使用柱式胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）依据说明书将电泳分离的基因扩增片段从琼脂糖凝胶中回收。用以拷贝为量级从依次稀释至。实时荧光定量反应使用的扩增引物为：正向序列，反向序列。反应体系检测了株经普通筛出的副溶血性弧茵。模板，分别为砌基因标准模板（）和待测的副溶血性弧茵基因组。基因标准模板各拷贝梯度均平行个复管作为定量基准，州正反向基因荧光定量引物各，探针，山缓冲液（含），热启动酶（，宝生物工程有限公司，大连），补足体系。反应条件为开始一个循环预变性分秒，接着个循环（秒；秒），采集荧光。荧光采集通道为，。作为空白对照。统计分析使用整理数据并绘制细菌值与菌液绝对计数值的标准曲线；

18、两组数据比较采用卡方检验（，统计计算使用软件（美国）；指数计算方法为“灵敏度特异度”。重庆医科大学硕士研究生学位论文实验结果副溶血性弧菌的培养及计数株处于对数生长期的副溶血性弧菌株值在之间，相应的显微镜下菌液的绝对计数值为个。两者的线性关系为（，）（图）。按此计算式可根据值推算出待测副溶血性弧茵菌液的绝对计数值。图菌液砷。值与显微镜下绝对计数值的相关性，注：对应方程为：，），：显微镜下绝对计数值（个），工：值。数据来源于株不同的副溶血胜孤茼的茵液测定值。使用部分序列鉴定副溶血性弧菌部分序列扩增使用序列检测的株副溶血性弧菌和作为对照的株其他临床分离菌株（）均扩增出的目的片段，空白对照为阴性。电泳

19、位置正确（图）。奄苦葛暑口茎墨重庆医科大学硬士研究±学位论文：一；分子标记（，天根生化科技有限套司，北京）：空白对照；：目的片段，（，（），）；，；测序比对结果株菌株的测序长度在之间，平均测序长度为。株（）副溶血性弧菌鉴定结果与生化培养法一致，株从腹泻患者分离的副溶血性弧菌分别鉴定为科氏葡萄球菌（，表皮葡萄球菌（）和（暂无对应的中文名称。作为对照的株其它临床分离菌株投有误削为副溶血性弧苗的例证。其中株（）临床分离菌与生化培养法鉴定结果一致，包括株奇异变形杆菌和株鲍氏不动杆菌的牲定结果与临床牛化培养法的结果完全符台，株（）有差异。株（）自廉分离菌与生化表型鉴定结果有差异（表）：株（）自

20、床分离苗的比对结果中，最佳配结果和次级匹配结果的得分相可，两序列的差异度为，不能与生化表型法的结粜相区分（表）。表对鉴定毫自生袁型墓定有著蔓异的茸株￥？重庆医科大学硕士研究生学位论文表型姜定釜鉴定结果比对相似覆盖度度大肪埃希酋肺炎克需伯茸铜绿假单胞筲嗜麦芽窄食单胞茵金黄色葡萄球菌￥溶血性葡萄球菌人葡萄球菌）￥表皮葡萄球酋木糖葡萄球菌星座链球茸粪肠球茵弗氏志贺茼志贺茵属普通变形杆菌赫氏埃希茸产酸克雷伯菌产气肠杆茼阴沟肠杆茵大肠埃希茼胁膝状假单胞菌膝状假单胞茵不动杆菌属纹带棒状杆菌里吊葡萄球茵马胃葡萄球菌，志贺菌属莱个种。金黄色葡萄球茸）￥溶血性葡萄球菌，粪肠球茼。大肠埃希茵中间链球茸脚细叩删伽招

21、朋忙舭希氏肠球菌打船。唾液链球茵鹑鸡肠球苗艺屎肠球茸墨壁垒堕墅！塑！竺竺丝业竺一一！羞堕堕堕墅丝丝翌竺！地坐！壁壁丝！壁壁丝，暂无对应的中文名称表最佳匹配与表型鉴定法结果不同但次匹配相同的菌株情况表型鉴定釜霉囊鉴定结果耋盖菱相似度金黄色葡萄球茵妻竺曼葡萄球箜金黄色葡萄球茵铜绿假单胞茵舰砌舢删鲫呐聊烹篇：黛怒舢蚴胁铜绿粤单胞茵粪肠球茵尿肠球茸重庆科人学硕士研究±学位论立溶血弧菌与株其它临床菌株序列的比对围困副溶血弧茵及其它帖床菌株序列匕对圈！嬲；蠹。薰巍垂避嫩簇囊二誉。炭；蒌慧瀵；瑟融囊囊毒麟囊鏊；辫。囊熬饕滋蘼蒌垂誊簇；器攀曩蒸墓。；囊拦墓。；誊蠹嚣震一震；蓬、疆；墓墓墓誉墓蘸萎耄墓

22、震，。：墓器警口口口？口口一一¨一驻燕鍪缝鬟善篓囊蠹墓喜二囊蠹蕊口一一震嚣篱基震戤？】¨口口口口一一；，鬟誊露：瓣蓬；雾癸雏霪噩嚣囊鬟；口口一一一一一鹱囊；零褥；霪垂鬻霉；黧豢篡露一翌一。一。；：。罡。蠢：娶！蠢器裟一麓蒸黧。篓蚕；嚷嚣荔蕈嚣荔；震蠹；誊荔嚣藩豢篓基誉繁辫篓荔缝舞雾羞蛩；器誊雾翳露黜嚣嬲星蛰燃鬟蠢臻蠢篓篓露雾；薰；器鍪一嚣罂霆东碰嚣嚣嚣嚣盛哥嚣辫耋簿耋器重庆科大学硕±研究生学位论文目注：奉图示范性地显示林副离血性孤茵和椿其它临床茼蚌（舢卯叫肋删）的序列比对蛄果共同保守碱基在比对序列下方用“嘬示比对序列范田为标识，在第赴。蛳恒哦口，），“一”致病性副

23、溶血性弧菌基因检测基因的扩增使州普通方法对腹泻患青水产品和水样三种来源分离的副溶血性弧菌（）：增，幽基因，共有株为菌，水样中无株。株幽株均扩增出长度为的¨的片段，位置在处（图）。焉一仍重庆医科大学硬士研究生学位论文基因的检出腹泻患者和环境中的副溶血性弧菌株分别为（），（）。两种来源的副溶血性弧菌基因的检出率有显著差异，）（表）。表临床与环境分离的副溶血性孤茼砌基因检出注：；船，（实时荧光定量反应结果随机选择株砌副溶血性弧菌定量基因拷贝水平。个复管的基因标准浓度测定的重复性符合要求（图）。空白对照在个循环内不能检测到值，显示该反应的检测灵敏度小于个拷贝“。其拷贝数（拷贝斗）的对数与值呈

24、线性关系（，）（图）。从株试验菌的定量结果可看出，根据待测菌株的值可计算基因的拷贝数，与待测菌液的绝对计数值比较可计算基因的群体拷贝水平（表）。图标准定量砌基因模板（拷贝）实时定量扩增曲线（）重庆科大学顼±研究学傅论立二口：十十卜十一燃甘麟勰攒嫩擀释肝肝阵蚪聋堡群”撕儿晖廿仆拈女一分剐代表标准定量基因模板。拷贝，探针采用一）标记，所甩仪器为（），洲定通道为。一）围基因起始持贝敷的对数值与值的标准曲线，。玎（）对应的方程为一目，卸（），：值模板起始拷贝数”拷贝）。重庆医科大学硕士研究生学位论文表十七株副溶血性孤茵的基因平均拷贝浓度神奈川溶血试验，脲酶反应和基因鉴定致病性副溶血性弧菌的能

25、力比较神奈川溶血试验腹泻患者，水产品和水样三种来源分离的副溶血性弧菌中，菌株分别为（），（）和（）。三种来源的副溶血性弧茵的溶血反应有显著差异（）（表）。表临床与环境分离的副溶血性孤茵的神奈川溶血反应注：。（）重庆医科大学硕士研究生学位论文脲酶反应株为脲酶阳性，其中株来自腹泻患者，株来自水样标本。两组副溶血性弧菌的脲酶反应有差异（）（表）。表临床与环境分离的副溶血性孤茵的脲酶瓦应注：，（）脲酶，神奈川溶血反应与基因检测相关性临床与环境分离的副溶血性弧菌中，株分别为（），（）。两种来源分离的脲酶阳性副溶血性弧菌中，株分别为（），（）（表）。表脲酶，神奈川溶血反应与基因检测相关性，重庆医科大学硕士

26、研究生学位论文讨论海产品是人类生活重要的食物来源之一。副溶血性弧菌广泛分布于近海岸海水和鱼虾，贝类及盐渍加工的海产品中，是引起许多沿海国家由食用海产品致食源性疾病的重要病原体之一。但是，自然环境和水产品中分离得到的大多数副溶血性弧菌都无致病性，为致病菌【丌。因此准确鉴定出致病性副溶血性弧菌，是对海产品实行卫生检疫控制，保障食品安全的一项要求。曾使用神奈川溶血实验将副溶血性弧茵分为阳性和阴性两类，对应致病性和非致病性群。大多数从水产品（）和环境中（）分离的副溶血性弧茵为神奈川现象阴性，而多数（）临床患者标本分离的菌株是神奈川现象阳性【】。但近来发现神奈川现象阳性并不完全对应于副溶血性弧菌的致病性

27、【。此外，大肠埃希菌，志贺氏茵，普通变形杆菌，葡萄球菌等也是经食源性传播可引起腹泻或食物中毒的细菌，其腹泻患者的炎症反应与副溶血性弧菌感染菌者相似。因此，在准确检测海产品中的副溶血性弧菌时也应与这些混杂菌区分开。使用部分序列鉴定副溶血性弧菌本研究中，我们对株副溶血性弧菌和株临床分离菌株用针对的引物扩增的的目的片段。产物测序以方式比对，细菌鉴定至种。株副溶血性弧茵鉴定正确，株从腹泻患者分离的副溶血性弧茵分别鉴定为科氏葡萄球菌（，表皮葡萄球菌（）和。作为对照的株其它临床分离菌株没有误判为副溶血性弧菌的例证。该结果表明，本文建立的分析可以作为副溶血性弧菌的一个鉴定标准。在株临床分离菌株中，有株的鉴定

28、结果与生化培养法有差异。具体差异类型为株（）大肠埃希菌经基因鉴定为志贺属菌（例志贺菌属某种，例弗氏志贺菌），株（）大肠埃希菌被鉴定为普通变形杆菌。大肠埃希茵与志贺菌属的相关性为【，但是如肠侵袭性大肠埃希菌与志贺菌的生化性状几乎相同【，¨们，生化培养法很难区分，因此可通过序列分析重庆医科大学硕士研究生学位论文进行区分。变形杆茵在固体培养基会出现迁徙生长，而大肠埃希茵无此反应。被鉴定为变形杆菌的两个大肠埃希菌株重新在血平板培养后，有一株出现明显波纹状菌落形态，证实是变形杆菌。株（）肺炎克雷伯菌经鉴定分别为产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，产酸克雷伯菌（株），（株）。克雷伯茵与产气肠杆菌的同源性为引，但二者的的基因（）相似性为，有建议将产气肠杆菌分类至克雷伯菌属【，。产气肠杆菌会出现动力和鸟氨酸脱羧酶阳性延迟反应（天），因此标准的生化（小时）鉴定会将其误鉴定为肺炎克雷伯菌【¨。在年从临床标本和植物中得到鉴定，通过检测，刀狙，椰，却和基因认为该菌株包括肺炎克雷伯茵第三群（），并认为一些（）早期被鉴定为肺炎克雷伯菌的临床菌株实际是阳，咖肠【】。生化培养法的原理是通过检测细菌的代谢产物来判断其分解代谢特征从而达到鉴定细菌的目的。但是由于细菌生长条件的差异，株系之间的生化代谢型差异较大，可能会不小于属种之间的距离，因此用于细菌的