大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究

1、大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究         10-10-26 14:34:00     编辑：studa20                          作者：杨敏，马平，徐文会，张宏江【摘要】  目的 探讨大鼠

2、急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情况。方法 将大鼠随机分为假手术组、下肢缺血再灌注组两组。夹闭大鼠股动脉并用张力带绑扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。观察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的表达。结果 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表达高于假手术组(P0.05)；缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P0.05)。结论 急性下肢缺血再灌注可能导致大鼠血栓前状态的形成。 【关键词】  肢体缺血再灌注；血栓前状态；血小板膜糖蛋白；血栓调节蛋白    Abst

3、ract：Objective  To investigate the emerge condition of thromb in rats after ischemiareperfusion of limb.Methods  The rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(N group)；the hind limb ischemia reperfusion group (IR group).An animal model of acute hind limb ischemiareperfu

4、sion was developed by clamping femoral artery and banding hind limb of rats.Changes in the expression of GPb/a of platelet membrane and TM of vascular endothelial cell in rats after ischemiareperfusion of limb were observed.Results  The expression of GPb/a of platelet membrane in the IR group w

5、as significantly higher than that of the N group (P0.05).The expression of TM of vascular endothelial cell in the IR group was significantly lower than that of the N group (P0.05).Conclusion  Acute hind limb ischemiareperfusion may induce the formation of prethrombotic state in rats.  

6、;  Key words：limb ischemiareperfusion；prethrombotic state；platelet membrane lycoprotein；thrombomodulin    缺血再灌注损伤是临床肢体血运重建后出现意外致残、致死的主要原因之一，是当今外科临床医生所常面对的具有挑战性的问题之一。创伤、断肢再植、术中使用止血带时间过长、腹主动脉瘤手术中钳夹血管及大血管栓塞再通等都可引起肢体缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤是处于顿抑、休眠的肢体在血运重建之后的损伤导致的机体生理、生化改变和各器官的病理改变，这种损伤几乎影响

7、到整个机体，进一步导致如心、肺、肾等远隔器官的损伤13，甚至发生多器官功能障碍4。尽管近来手术技术得以改善且围手术期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何认识再灌注损伤的预防和治疗，降低致残率和死亡率，将是我们长期所要研究的课题。    缺血再灌注损伤的机制是多因素和错综复杂的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究证实再灌注时血管内皮细胞和白细胞激活，内皮细胞释放多种黏附分子，激活的内皮细胞与白细胞相互作用，对微血管和细胞损伤产生影响。150多年前，Virchow就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多

8、因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，是血栓形成的前期阶段。本试验通过黏附分子血小板膜糖蛋白GPb/a和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的测定，从血管内皮损伤、血小板活化、抗凝作用减弱三个方面对肢体缺血再灌注后血栓前状态进行研究。    1  材料和方法    1.1  实验材料51光学显微镜，日本；LeicaRM2015切片机，德国莱卡公司；IDA2000数码显微图象分析系统，中科院北京空海科技公司；Calibur流式细胞仪，美国BD

9、公司。    1.2  实验方法    检测TM需取血管，取股动脉、股静脉，脱水、石蜡包埋，用免疫组化方法定性检测血管内皮细胞上TM的表达。步骤如下：a)切片常规脱蜡至水，二甲苯(20 min)二甲苯(20 min)100酒精(10 min)100酒精(10 min)95酒精(10 min)85酒精(10 min)70酒精(10 min)。b)3H2O2室温孵育510 min，以消除内源性过氧化物酶的作用。蒸馏水冲洗2 min，冲洗3次。c)热修复抗原：将切片浸入0.001M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断

10、电，间隔8 min后，重复1次，冷却2 h，冷却后PBS液(pH 7.4)洗涤2 min，冲洗2次。d)滴加5BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。e)滴加稀释150的一抗(抗大鼠IgG)，4过夜。PBS液冲洗2 min，冲洗3次。f)滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS液冲洗2 min，冲洗3次。g)滴加试剂SABC室温20 min。PBS液冲洗5 min，冲洗4次。h)DAB显色，自来水冲洗。i)苏木素轻度复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。再用BX51型Olympus显微镜及IDA2000数码显微图像分析系统进行图像分析，每组观察30个高倍视野

11、(×400)，随机取8个视野，以平均光度为指标进行半定量分析。    1.3  统计学分析  用SPSS 11.5统计软件，实验数据以(±s)表示，组间均数比较采用t检验。检验水准取0.05，P0.05差异有显著性。    2  结    果    2.1  缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表达为(53.84±3.05)，高于假手术组(42.31±6.29)，二者比较具有统计学意义。

12、60;   2.2  缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P0.05)(见表1)表1  急性肢体缺血再灌注大鼠血管内皮细胞TM的表达注：假手术组与缺血再灌组比较P0.05    3  讨    论    早在1944年，Jesse等5对止血带引发休克研究发现，止血带使用时间不超过3 h，引发止血带休克可能性极小，相反止血带使用时间超过3 h，则较易导致止血带休克，这种止血带休克不能通过静脉补充容量来预防。后来人们对动物骨骼肌缺血代谢变化进行研究发现，随着缺血开始，骨骼肌的无氧代谢开始，细胞内的三磷酸腺苷、磷酸肌酸进行性耗竭，缺血3 h三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后1 h磷酸肌酸就完全水解。在28下，如果止血带时间不超过3 h，随着再灌注开始，细胞内三磷酸腺苷在再灌注2 h后恢复正常水平，而磷酸肌酸则在再灌注后1 h恢复到正常水平。如果缺血超过3 h，而缺血的肢体温度保持在2，也不会导致细胞内三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，从而避免了细胞损伤。这可能与低温下细胞能量代谢