实验性脑缺血再灌注大鼠外周血CINC的变化

1、    实验性脑缺血再灌注大鼠外周血CINC的变化        摘要目的：为了探讨脑缺血再 灌注外周血细胞因子介导的粒细胞趋化因子(CINC)水平的变化，采用动物实验方法对实验 性脑缺血再灌注不同时间内外周血CINC和髓质过氧化物酶(MPO)活性的变化进行了观察。方法：选用改良线栓法复制Sprague-Dawley(SD)大鼠脑缺血再灌注实验 模型。对不同时间内的血清MPO活性及CINC水平进行测定。结果：单纯缺血组MPO活性增高始于缺血6h并于缺血72h时达高峰，为0.1

2、5±0.01U/ml; CINC水平 增高始于缺血1h，缺血6h时达高峰，为0.05±0.05ng/ml，以后逐渐下降并于缺血48h后 恢复正常。缺血1小时再灌注组MPO活性增高始于再灌注1h并于再灌注24h时达高峰，为0.42 ±0.12U/ml；CINC水平增高始于再灌注1h，再灌注3h时达高峰，为0.65±0.03ng/ml，以后逐渐下降并于再灌注24h后恢复正常。结论：实验性脑缺血再 灌注外周血CINC有表达增高改变，其作用过程可能与白细胞激活过程有关，提示CINC增高 可能在脑缺血再灌注损伤中起一定作用。关键词细胞因子介导的中性粒细胞化学吸附剂

3、髓质过氧化物酶脑缺血再灌注 The changes of cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC) in blood of experimental cerebral ischemia reperfusion with ratsCao Xuebing, Sun Shenggang, Tong Etang et alDepartment of Neurology, the Union Affilated Hospital of Tongji Medical, Unive rsity, Wuhan 430022Abstract Object

4、ive：The purpose of study was to a ssess the changes rule of cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC). Methods: In different time, the concentrations of CINC and the activities of myeloperioxidase (MPO) were observed in experimental cerebral isc hemia reperfusion model with Sprague-Dawley(SD

5、) rats made by modified thread em bolism method. Results:In ischemia group, the peaks of MPO activity and CINC conentr ation were 24 hour and 6 hour respectively after ischemia, which initially incre ased at 1 hour, In ischemia reperfusion group, the peaks of MPO activity and CIN C conentration were

6、 72 hour and 6 hour respectively after ischemia reperfusion, which initially increased at 6 hour and 1hour down to normal at 24hour respectiv ely. Conclusion: The rise of CINC was an effect of activiting WBC after the ischemia or ischemia reperfusion and indicated that the change was involving in th

7、e damage of ischemia reperfusion.Key words Cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC ) Myeloperioxidase(MPO) cerebral ischemia/reperfusion细胞因子介导的粒细胞趋化因子(CINC)为一种有72个氨基酸残基的碱性蛋白，分子量约15.6KD的二聚体。有学者将CINC称为IL-8样中性粒细胞趋化因子，IL-8与CINC的同源性为47.2%，免疫学证实鼠CINC与人IL-8两者并无交叉反应，它们的趋化作用能力也不同，鼠CINC特异性趋化粒细胞，又称为中性

8、粒细胞特异性趋化因子1。近年来，白细胞在急性脑卒中发病机制中的作用得到了进一步的阐述。至于CINC与脑血管病的发病关系尚不十分明确。为了解脑缺血及缺血再灌注后血清CINC的变化规律，我们利用动物模型对MPO和CINC的变化进行了观察，现报告如下：材料与方法一、实验动物：128只雄性SD大白鼠，由湖北医科大学实验动物饲养中心提供，体重225g250g，分为单纯缺血和缺血1小时再灌注两部分。单纯缺血部分又随机分为对照组、缺血1、3、6、12、24、48、72小时(h)共8组。缺血1小时再灌注两部分又随机分为缺血1h未灌注组、再灌注1、3、6、12、24、48、72h共8组。每组动物均为8只。其中每

9、组6只大鼠用作免疫及生化检测，其余则用于组织病理学观察。二、实验方法：采用Yuji(1995)2报道的大白鼠局灶性脑缺血再灌注线栓模型稍加改进。麻醉前10分钟大鼠腹腔注射阿托品(5mg/100g)，麻醉用10%水合氯醛腹腔注射(3040mg/100g)，麻醉后仰卧固定于手术台上，颈部正中切开，逐层分离组织，暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎CCA近端、ECA根部。在CCA结扎处远端剪一斜口，经此斜口插入尼龙丝，经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA)以阻断MCA的血流。尼龙丝平均插入深度为18.5±0.5mm，结扎ICA以固定尼龙丝和防

10、止出血，缝合皮肤，尼龙丝末端暴露在外。脑缺血未灌注组不拔出尼龙丝使脑组织缺血；再灌注组缺血1h后，拔出尼龙丝再灌注不同时程。假手术组除不插入尼龙丝外，其余步骤同脑缺血未灌注组；正常对照组不作任何处理。三、血样留取单纯缺血部分分别在手术前及缺血后1、3、6、12、24、48、72h采取静脉血2ml；缺血1h再灌注部分分别在再灌注1、3、6、12、24、48、72h采取静脉血2ml。低温(4)3000rpm分离血清，置-80保存待检。四、测试方法：CINC测定试剂由日本国岗山大学免疫系李君武博士赠送，抗体效价为11000，CINC标准品浓度为100ng/ml。按ELISA法测定血清中CINC水平。

11、MPO活性测定用Barone等3报道的方法。MPO活性用标准溶液计算。IUMPO定义为：25下每分钟分解1mol过氧化物。五、统计方法：分别计算不同时间测定后的结果平均值及标准差，并与对照组比较行t-检验。结果一、不同缺血时间血清中MPO活性、CINC水平的变化(表1)：表1不同缺血时间MPO活性(U/ml)、CINC水平(ng/ml)的变化缺血前缺血后1h3h6h12h24h48h72hMPO0.01±0.0020.01±0.0020.01±0.0020.01±0.002*0.05±0.01*0.08±0.01*0.10±

12、0.005*0.15±0.01*CINC00.06±0.020.15±0.05*0.55±0.05*0.25±0.06*0.11±0.04*0.06±0.030本项试验结果看，MPO活性增高始于缺血6h并于缺血72h时达高峰，为0.15±0.01U/ml。缺血6h以上各组MPO活性与缺血前比较，差异均有极显著性意义(P<0.01，见表1)。CINC水平增高始于缺血1h，缺血6h时达高峰，为0.55±0.05ng/ml，以后逐渐下降并于缺血48h后恢复正常。缺血3h以上各组血清CINC水平均高于缺血1

13、h组，差异均有极显著性意义(P<0.01,见表1)。 表2缺血1小时不同再灌注时间MPO活性(U/ml)、CINC水平(ng/ml)的变化缺血1h再灌注后1h3h6h12h24h48h72hMPO0.01±0.0020.04±0.005*0.08±0.005*0.10±0.01*0.20±0.02*0.42±0.12*0.35±0.08*0.12±0.01*CINC0.06±0.020.25±0.05*0.65±0.03*0.32±0.04*0.16±0.02

14、*0.11±0.01*0.06±0.030二、缺血1小时不同再灌注时间MPO活性、CINC水平的变化(表2)：本项试验结果看，MPO活性增高始于再灌注1h并于再灌注24h时达高峰，为0.42±0.12U/ml。再灌注1h以上各组MPO活性与缺血1h比较，差异均有极显著性意义(P<0.01，见表2)。CINC水平增高始于再灌注1h，再灌注3h时达高峰，为0.65±0.03ng/ml，以后逐渐下降并于再灌注24h后恢复正常。再灌注1h至24h各组血清CINC水平均高于缺血1h组，差异均有极显著性意义(P<0.01，见表2)。 讨论炎性细胞在缺血组

15、织的聚集是脑缺血后导致功能残迹的重要因素之一。淋巴细胞活化并通过血脑屏障迁移入中枢神经系统的机制尚未完全清楚。炎性过程被认为由局部产生的前炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-、IL-1和IL-6所诱导的4。这些细胞因子还对培养的脑血管内皮细胞具有诱导作用并能增强几种粘附分子包括细胞间粘附分子-1，血管性细胞粘附分子-1和E-选择素表达的能力。而且，体外用前炎性因子刺激胶质细胞和内皮细胞也能诱导细胞因子的表达，而这些因子为低分子量的蛋白质、特异性地趋化特定的淋巴亚群到炎性区域。本研究发现血清中CINC水平呈短暂性增高，此结果与Yamasaki7的一致，提示这种细胞因子在趋化血液中的多形核白细胞(PMNL

16、)到脑缺血位点中起一定的作用。CINC同IL-8一样，为一强烈的对PMNL起化学趋化作用的物质5。在人皮下注射IL-8能诱导粒细胞滤出血管外并持续几个小时。除了趋化PMNL，IL-8也能刺激粒细胞释放颗粒和这些细胞的呼吸爆发。粒细胞释放颗粒的同时还有补体和整和素含量的上调，从而进一步促进滤过细胞的粘附6。在脑缺血再灌注大鼠中，高浓度的IL-8相关粒细胞化学吸附剂出现在脑组织和血清中7。在脑内，细胞趋化至炎性位点的机制没有完全清楚。但是，在缺血脑组织局部IL-8/CINC产生增多可能导致IL-8/CINC呈浓度梯度性渗过血脑屏障，从而引起外周血IL-8浓度的升高，本研究结果也说明了这一点。在化学

17、趋化过程中，细胞的迁移是沿着浓度梯度方向进行的，最终导致粒细胞快速流向脑实质，引起局部炎性反应8。因为脑缺血时脑内PMNL的滤过时间延长，高峰在刺激后的24到72小时，这也为开始治疗提供了足够的时间，特别是在溶栓治疗时。MPO是中性粒细胞和单核细胞所特有的细胞内酶，而单核细胞内此酶的活性较低，因此以MPO活性反映组织内中性粒细胞积聚并作为炎性细胞浸润的定量指标是很有价值的3。Matsuo等9认为缺血1h提供了足够的刺激诱导脑缺血区血管内中性粒细胞聚积。在实验中，单纯缺血组各时间点MPO活性、CINC水平都处于较低水平且增高所需时间较长，间接表明脑缺血时中性粒细胞滤出出现得晚且数量可能也较少。缺

18、血1h再灌注组各时间点MPO活性、CINC水平明显增高而且所需时间较短。这表明随着脑血流的再通，血管通透性增加，使得中性粒细胞滤出增多且快速，而中性粒细胞的大量活化又进一步促使了CINC的表达。因此，本研究结果更加证实了再灌注造成的脑损伤作用比单纯缺血更严重10，但是CINC在脑缺血再灌注损伤中的地位仍有待阐明。作者单位：曹学兵（同济医科大学附属协和医院神经内科430022）孙圣刚（同济医科大学附属协和医院神经内科430022）童萼塘（同济医科大学附属协和医院神经内科430022）黄怀钧（湖北医科大学附属第二医院神经内科）杨明山（同济医科大学附属同济医院神经内科）参考文献1Watanabe K

19、, Suematsu M, Lida M, et al. Effect of rat CI NC/gro, a member of interleukin-8 family, on leukocytes in microcirculation of the rat mesentery.Exp Mol Pathol, 1992;5660-69.2Yuji K, Kazuo M, Takenori Y, et al. Nylonmonofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stoke, 1995,26

20、1655.3Barone FC, Hillegass Lm, Price WJ, et al. Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue: myeloperoxidase activity assay and histologic verification, J Neurosci Res. 1991;29336-348.4Kim JS. Cytokines and adhesion molecule in stroke and related diseases . J Neurol

21、Sci. 1996;13769-78.5Huber AR, Kunkel SL, Todd RF, et al. Regulation of transedothelial neu trophil migration by endogenous interleukin-8. Science, 1991;25499-102.6Detmers P, Lo SK, Olsen-Egbert E, et al. neutrophil-activating prote in-1/interleukin-8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion r eceptor CD11/CD18 on human neutrophils. J Exp Med. 1990;1711155-1162.7Yamasaki Y, Matsuo Y, Matsuura N, et al. Transient increase