农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

1、分子植物育种，2006 年，第 4 卷，第 2 期，第 228-232 页Molecular Plant Breeding, 2006, Vol.4, No.2, 228-232研究报告Research Report农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究袁鹰 1李启云 1郝文媛 1谭化 1孔祥梅1张光弟 2刘德璞 1*1 吉林省农业科学院生物技术研究中心, 公主岭, 136100; 2 吉林省梨树县农业技术推广站, 四平, 136500摘要以东北春玉米自交系 7922、340、78599、921 及美国杂交种 H99 等幼胚愈伤组织为受体，利用农杆菌介导法转化 Bt(CryIA.基因，研究菌液预

2、处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素对转化频率的影响。根据转化愈伤组织的除草剂(Basta抗性筛选结果评估转化率，表明继代培养 35d 的愈伤组织适于转化，其中以继代 5d 的 7922 愈伤组织转化率最高，为 46.6%；不同基因型对农杆菌转化率存在差异，H99 的抗性愈伤组织率为 34.57%，7922 为 26.27%、340 为 21.36%、78599 和 921 抗性愈伤组织率仅为8.02%和 6.78%。基因型间差异显著；浸染培养基中加入(AS100200mg/L抗性愈伤转化率明显提高；菌液浓度 OD600 0.50.6、侵染时间 510min、共培养时间

3、3d 最佳。关键词农杆菌介导法, 转化频率, 影响因素, 抗性愈伤组织Studies on Influencing Factors of Agrobacterium tumefaciens MediatedMaize TransformationYuan Ying1Li Qiyun1Hao Wenyuan1Tan Hua1Kong Xiangmei1Zhang Guangdi2Liu Depu1*1 Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling, 136100; 2 Agriculture Generalize Station of L

4、ishu County , Siping, 136500Abstract Maize inbred lines in Northeast (7922、340、78599 etc. immature embryos calli were transformed byAgrobacterium tumefaciens (CryIA Bt. in this report. Factors influencing transformation efficiency were studied,including pre-treatment, callus state, infection medium,

5、 infection time and co-cultivation et al. Results showedthat callus subculture for 35 days was suitable for transformation and that transformation efficiency of 7922 callusreached the highest of 46.6% after 5 days subculture. Dominant difference existed among different maize genotypeon infection sen

6、sitivity and H99 was the most sensitive genotype with 34.57% resistant callus. Transformation effi-ciency was improved obviously with acetosyringone (AS (100200mg/L appended in medium. In addition, bac-terium concentration (OD600 0.50.6, 510 minutes infection time and co-culture 3 days were the opti

7、mal condi-tions for Agrobacterium tumefaciens mediated maize transformation.Keywords Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, Transformation efficiency, Influencing factors,Resistant calli玉米是重要的粮食、饲料，又是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料。中国是世界上第二大玉米生产国，玉米在我国经济生产中占有非常重要的地位。在玉米生产上，虫害是导致玉米减产的重要危害之一。玉米螟是我国大

8、部分主产区的主要玉米害虫，因而我国玉米害虫的综合防治研究基本上是围绕玉米螟展开的。玉米螟的防治应以农业防治为基础，协调生物防治，化学防治，物理防治等不同方法。物理防治主要是消灭越冬虫源、改进耕作制度、种植抗虫品种；化学防治主要根据不同生育期喷洒化学杀虫剂；生物防治主要是在玉米螟产卵盛期释放赤眼蜂可达到较好的效果。而化学防治和生物防治一个污染环境一个成本高，在玉米害虫的综合治理中，抗虫品种的利用是一项长期而有效的措施，培育抗虫品种已经成为育种家的重要目标。以杂交技术为基础的传统作物品种选育方法由Page 2于抗源缺乏难以实现目的，引入外来基因存在周期长、效率低、杂交不育等问题。现代生物技术育种打

9、破了植物种属甚至物种之间难以杂交的天然屏障，可以实现远缘抗虫基因的转移，使作物迅速地、定向地获得抗虫性，同时又能保留原有的良好农艺性状(袁鹰等, 2005。用基因工程技术改良玉米，培育具有高产、优质和抗逆性强的新品种，表现出很强的潜力(王关林和方宏筠, 1998。目前玉米的遗传转化方法主要有基因枪法和农杆菌转化法。而农杆菌转化方法以其廉价，简单可以转移大片段的 DNA，且以低拷贝整合到植物染色体等诸多优点越来越受到人们的青睐 (Cheng et al.,2001。迄今为止农杆菌介导法的遗传转化已在 20多种单子叶植物中取得成功，其中包括重要的禾谷类作物(刘明志, 1996。尤其是近几年，农杆菌

10、转化法在重要的农作物水稻、玉米、小麦上取得了突破性进展 (Hiei et al., 1994; Gould et al., 1991; Cheng et al.,1997。Ishida 等(1996用含超双元载体的农杆菌转化玉米幼胚 A188 获得成功，成为农杆菌转化玉米的一个里程碑。1999 年，先锋种子公司 Zhao 等获得了农杆菌转化玉米骨干自交系的专利。我国黄璐、张荣等(黄璐和卫志明, 1999; 张荣等, 2001采用农杆菌转化玉米单交种胚性愈伤组织成功并再生植株。本研究用农杆菌介导法向东北春玉米自交系7922、78599、340、921 及美国杂交种 H99 幼胚诱导出来的 II

11、型愈伤组织，转移苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis 杀虫蛋白基因(CryIA结果获得了抗性愈伤组织，并分化出植株。并对影响转化效率的因素进行了探讨，根据抗性愈伤组织产生频率对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，提高了农杆菌介导法转化东北春玉米自交系的转化频率，为今后培育抗虫转基因品种打下坚实的基础。利用建起的该转化系统，在几年多批转化实践中已得到预期的效果，对获得的转基因后代连续 3年进行分子检测和田间接虫鉴定筛选出一批稳定的抗虫自交系。1 材料与方法1.1 材料与试剂玉米自交系 7922、78599、340、921 由吉林省农业科学院玉米研究中心提供，H99 由美国 IU

12、S 大学王侃惠赠。携有 GFM CryIA Bt.载体的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因由郭三堆先生所提供(图 1。所用的载体为 pBI121 包含 Bt 杀虫蛋白基因和新霉素磷酸转移酶(NPTII基因，筛选标记 Bar 基因，启动子为 35S，终止子 Nos 3' 序列，目的基因序列全长 1824bp，编码 608 个氨基酸。愈伤组织诱导培养基：MS 大量，MS 微量，MS维生素，100mg/L 肌醇，水解酪蛋白 500mg/L，L- 脯氨酸 500mg/L，L- 天门冬酰胺 200mg/L，泛酸钙0.5mg/L，生物素 0.05mg/L，2,4-D 1.5mg/L，蔗糖4%(w/v。继代

13、培养基：MS 大量，MS 微量，MS 维生素，100mg/L 肌醇，水解酪蛋白 500mg/L，2,4-D 2.0mg/L，蔗糖 3%(w/v。菌液悬浮培养基：1/2 MS 大量，1/2 MS 微量，1/2MS 维生素，100mg/L 肌醇，水解酪蛋白 500mg/L，2,4-D 1.5 mg/L AS100mg/L+3.6%蔗糖+6.8%葡萄糖，pH5.2。共培养培养基：1/2 MS 大量，1/2 MS 微量，1/2MS 维生素，2,4-D 1.5 mg/L AS100 mg/L AgNO3850mg/L+ 半光氨酸 100 mg/L+3%蔗糖。恢复培养基：1/2 MS 大量，1/2 MS

14、微量，1/2 MS维生素，2,4-D 1.5mg/L+MES 0.5g+AS100mg/L+Cef500mg/L+3%蔗糖。筛选培养基：D1：1/2 MSZ+2,4-D 1.5 mg/L +MES 0.5g +Cef 500mg/L+Basta 1.5+3%蔗糖；D2：N6 +水果制品生产许可证审查细则（2006版）一、发证产品范围及申证单元实施食品生产许可证管理的水果制品是以水果为原料，经各种加工工艺和方法制成的产品。水果制品的申证单元为2个：水果干制品和果酱。在生产许可证上应注明获证产品名称及申证单元，即水果制品(水果干制品、果酱。生产许可证有效期为3年，其产品类别编号为1702。二、基本

15、生产流程及关键控制环节（一）基本生产流程。1水果干制品选料清洗整理护色（或不护色）干燥（脱水）后处理（或不经后处理）包装2果酱选料清洗整理软化打浆配料浓缩灌装杀菌冷却包装（二）关键控制环节。1水果干制品（1）原料的验收和处理；（2）食品添加剂的使用；（3）干燥（脱水）；（4）包装。2果酱（1）原料的验收和处理；（2）浓缩；（3）杀菌。（三）容易出现的质量安全问题。1水果干制品（1）超范围和超量使用食品添加剂；（2）发霉变质。2果酱（1）变色、分层；（2）糖结晶；（3）发霉变质，微生物超标。三、必备的生产资源（一）生产场所。1水果制品生产企业除必须具备的生产环境外，还应设置与企业生产相适应的验收

16、场所、原料处理场所、原辅材料仓库、生产车间、包装车间、成品仓库。2分装企业应具备独立的包装车间、原辅材料仓库、成品仓库。（二）必备的生产设备。1水果干制品原料处理设备、干燥（脱水）设备、包装设备；分装企业应具备包装设备。根据生产工艺不同还需配置相应的打浆设备、压榨设备、粉碎设备、筛分设备等。采用自然晾晒方式进行干燥的产品，审查必备生产资源时，可以不要求干燥（脱水）设备，但需有相应的晾晒场所。晾晒场四周有围墙或纱网等防护措施，产品不得直接接触地面，地面用水泥或坚硬材料铺砌，便于清洗和排水。2果酱原料处理设备、浓缩设备、灌装设备、灭菌设备、包装设备；分装企业应具备灌装、灭菌和包装设备。四、产品相关

17、标准GB 16325-2005干果食品卫生标准；GB 14891.3-1997辐照干果果脯类卫生标准；GB 19586-2004原产地域产品 吐鲁番葡萄干；QB/T 2076-1995水果、蔬菜脆片；NY/T 705-2003无核葡萄干；NY/T 709-2003荔枝干；NY/T 786-2004食用椰干；NY/T 948-2006香蕉脆片；NY/T 487-2002槟榔干果；GB 2761-2005食品中真菌毒素限量；SB/T 10196-1993果酱通用技术条件；备案有效的企业标准。五、原辅材料的有关要求水果制品生产加工所用的原辅材料必须符合相应的国家标准、行业标准及有关规定，不得使用非食

18、用性原料。水果制品所选用的原料应无异味、无腐烂、无腐烂现象，农药残留及污染物限量应符合相应国家标准、行业标准的规定。如使用的原辅材料为实施生产许可证管理的产品，则必须选用获得生产许可证企业生产的合格产品。六、必备的出厂检验设备（一）天平（0.1g）；（二）分析天平（0.1mg）（水果干制品）；（三）干燥箱；（四）灭菌锅；（五）无菌室或超净工作台；（六）微生物培养箱；（七）生物显微镜（八）折光仪（果酱）。若水果干制品执行标准中无菌落总数和大肠菌群检测项目时，检验设备（四）（七）不做要求。七、检验项目水果干制品和果酱的发证检验、监督检验和出厂检验按表中列出的检验项目进行。出厂检验项目中注有“*”标

19、记的，企业应当每年检验2次。如果产品没有国家标准或者行业标准，应制定企业标准。标准中应包括以下检验项目：水果干制品中的水分，果酱产品中的可溶性固形物、菌落总数、大肠菌群。水果干制品质量检验项目序号检验项目发证监督出厂备注1感官2净含量3等级标准中有此规定的4水分（或果肉含水率）5粒度*标准中有此规定的6总酸*标准中有此规定的7酸价*标准中有此规定的8过氧化值*标准中有此规定的9脂肪*标准中有此规定的10蛋白质*标准中有此规定的11铅(以Pb计*标准中有此规定的12砷(以As计*标准中有此规定的13铜(以Cu计*标准中有此规定的14汞(以Hg计*标准中有此规定的15镉（以Cd计）*标准中有此规定

20、的16二氧化硫残留量17苯甲酸*18山梨酸*19糖精钠*20环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）*21着色剂（柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝）*检测时应根据产品的颜色确定22展青霉素*苹果、山楂制品23六六六*标准中有此规定的24滴滴涕*标准中有此规定的25抗氧化剂（BHA+BHT）*标准中有此规定的26三唑酮*标准中有此规定的27菌落总数标准中有此规定的28大肠菌群标准中有此规定的29致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）*标准中有此规定的30霉菌*标准中有此规定的31标签果酱质量检验项目td 序号检验项目发证监督出厂备注1感官2净含量3可溶性固形物4总糖（以转化糖计）*标准

21、中有此规定的5铅(以Pb计*标准中有此规定的6铜(以Cu计*标准中有此规定的7总砷(以As计*标准中有此规定的8苯甲酸*9山梨酸*10糖精钠*11环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）*12着色剂（柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝）*检测时应根据产品的颜色确定13展青霉素*苹果、山楂制品14菌落总数p15大肠菌群16致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）*标准中有此规定的17霉菌*标准中有此规定的18标签八、抽样方法根据企业申请发证产品的品种，在企业成品库房内按照每个发证单元随机抽取一种产品进行发证检验。所抽样品须为同一批次保质期内的产品，抽样基数不得少于20kg，抽样数量为1.3

22、 农杆菌培养12个独立包装）,分为2份，1份检验，1份备查；样品经确认无误后，由核查组抽样人员与被抽查单位在抽样单上签字、盖章、当场封存样品，并加贴封条，封条上应有抽样人员签名、抽样单位盖章及抽样日期。九、其他要求水果干制品和果酱产品允许分装。果酱罐头生产企业按照罐头细则进行现场审查。180r/min 震荡培养至对数期，5 000r/min 离心 10min收集农杆菌，并用重悬液悬浮至 OD600 为 0.31.0 待用。图 1 质粒 T-DNA 区Figure 1 The T-DNA region of plasmid农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究Studies on Influenc

23、ing Factors of Agrobacterium tumefaciens Mediated Maize Transformation229Page 3分子植物育种Molecular Plant Breeding1.4 农杆菌侵染和共培养将继代 212d 的愈伤组织分别集中于一个小三角瓶中，用制备好的农杆菌液 (OD600 为 0.5 浸泡 10min，弃菌液，置于带滤纸的培养皿中，吸去多余的菌液，然后将愈伤组织放在垫滤纸的共培养基上，27共培养 16d。1.5 不同浓度的农杆菌侵染将继代 5d 的愈伤组织集中于一个小三角瓶中，分别用 OD 值为 0.3、0.5、0.6、0.8、1.0

24、的菌液浸泡 10min，其余步骤同 1.4。1.6 酚类物质乙酰丁香酮(AS的处理将继代 5d 的愈伤组织分别集中于一个小三角瓶中，分别浸于含 AS 0、100mg/L、200mg/L 农杆菌菌液和共培养基上。其余步骤同 1.4。1.7 抗性愈伤组织的的筛选将共培养 3d 后的愈伤组织置恢复培养基上，10d 后置于筛选培养基上进行筛选。每 10d 更换一次新鲜培养基，每次都挑选长势旺盛的愈伤组织进行继代。1.8 调查项目及统计方法调查记录每一个基因型经过 3 次筛选之后的抗性愈伤数，以抗性愈伤 / 愈伤总数伊100%计算转化频率，以百分率经反正弦进行方差分析和显著性测验。2 结果与分析2.1

25、不同基因型玉米对农杆菌的敏感性玉米不同基因型对农杆菌的反应以及农杆菌对玉米的侵染能力直接影响到玉米的遗传转化效率。本研究将 5 个玉米自交系幼胚诱导出来的愈伤组织各 400 块用农杆菌侵染，共培养 3d 后，在培养基中加 Basta 3mg/L 做 3 次筛选，未转化的愈伤逐渐褐化死亡，而获得转化的抗性愈伤正常生长。根据抗性愈伤组织的产生频率作统计分析(表 1 和表 2。结果表明，重复间没有达到显著水平，而不同基因型间存在显著差异，说明不同基因型的玉米对根癌农杆菌侵染的敏感性不同。H99 对农杆菌最敏感，抗性愈伤组织率为 34.57% ，其次是 7922，为26.27%，340 为 21.36

26、%而 78599、921 抗性愈伤率仅为 8.02%和 6.78%。从不同基因型玉米的农艺性状角度看，虽然 H99 愈伤组织易诱导，抗性愈伤组织率亦较大，但它的熟期太早、秆矮、易感病，农艺性状不好，所以一般不宜作育种材料直接利用，我们认为转化效率最好的基因型是 7922，与其它基因型间存在显著差异。表 1 玉米基因型对根癌农杆菌敏感性的方差分析Table 1 The variance analysis of sensitity of genotypes in maizeto lines of Agrobacterium变异来源Source重复间Repeat基因型间Genotypesof mai

27、ze误差Error总计Total自由度DF341219平方和SS39.41472280.6826104.91382425.0111均方MS13.1382570.17068.7428F 值F-value1.50365.216F0.050.26390表 2 玉米基因型对根癌农杆菌敏感性的显著性测验Table 2 The significance test of sensitivity of genotypes in maizeto line of Agrobacterium基因型GenotypesH99792234078599921抗性愈伤率(%Frequency of resist calls3

28、4.5726.2721.368.026.78显著性SingnificanceF0.05F0.01aAbBcBdCdC2.2 愈伤组织的生长状态对转化频率的影响分别用继代 2、3、5、6、7、10、12d 的愈伤组织进行侵染，通过 3 次抗性筛选后，抗性愈伤组织频率不同，结果(表 3，愈伤组织的生长状态直接影响转化的频率。其中 7922 以继代 5d 的愈伤组织转化率最高，达到了 46.6%，而继代 2d 和继代 12d 的愈伤组织侵染后抗性愈伤组织频率较低分别为 10%和 21.2%。2.3 不同菌液浓度(OD600 值对玉米转化的效果菌液浓度是影响遗传转化的关键因素之一。本实验用 OD600

29、 值分别为 0.3、0.5、0.6、0.8、1.0 的菌液侵染7922 胚性愈伤组织 10min，结果(图 2显示 OD600 值在0.50.6 为宜，抗性愈伤组织频率最高，可达 60%左右，低于 0.3 和高于 0.8 抗性愈伤频率低于 20%。2.4 共培养时间对玉米转化效率的影响230Page 4农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究Studies on Influencing Factors of Agrobacterium tumefaciens Mediated Maize Transformation继代 5d 的 7922、78599 的 II 型愈伤组织与OD600 值为 0.

30、6 的农杆菌分别共培养 1、2、3、4、5、6d后，经连续 3 次筛选，结果前 13d 抗性愈伤数呈上升趋势，而 3d 后抗性愈伤数反而呈下降趋势(图 3，共培养 56d 后的愈伤组织周围明显能看到农杆菌的生长，愈伤组织生长受到抑制，在筛选过程中由于菌没能抑制住最后淘汰。2.5 乙酰丁香酮对转化频率的影响在重悬液、共培养基和恢复培养基中信号分子(乙酰丁香酮的使用，明显的提高抗性愈伤率，在不加 AS 的情况下 8%的水平基础上提高 60%以上，达到 14%。100mg/L 和 200mg/L 没有明显差异，基本一样。3 讨论据国内外报道，玉米农杆菌介导转化，通常是直接浸染发育 1020d 的玉米

31、幼胚，Ishida 等(1996用含超双元载体对玉米的农杆菌成功转化受体是 A188 幼胚，先锋种子公司 Zhao 等(1999获得农杆菌转化玉米骨干自交系的专利也是用 A188 幼胚。国内张荣等(2001报道建立了对玉米的农杆菌转化体系同样也主要是用幼胚。但幼胚做侵染转化受取材时间限制，用来自幼胚诱导的胚性愈伤组织做农杆菌介导转化的受体更有优越性。黄璐和卫志明(1999采用农杆菌转化胚性愈伤组织获得再生植株的材料为 A188伊B73的玉米单交种，权瑞党等(2003以农杆菌 LBA4404 介导将潮霉素磷酸转移酶 (hygromycic phosphotrans-ferase，HPT和来自大肠

32、杆菌的 betA 基因导入玉米骨干自交系齐 319、掖 515、掖 502 等胚性愈伤组织，并由筛选出的抗性愈伤组织再生出可育植株。但他们使用的自交系源自山东。东北是我国玉米的重要主要生产地，围绕东北的春玉米转基因是十分必要的。本试验研究以东北骨干自交系的幼胚胚性愈伤组织做农杆菌介导转化的受体，研究转化影响因素。从上面对不同基因型之间的差异分析可以看出基因型差异是玉米转化中不可忽视的问题，基因型间存在着其内在的特殊性，这也是我们就东北春玉米自交系的转化做影响因素研究的原因。由于愈伤组织来源于不同自交系，在愈伤状态、结构、对农杆菌的敏感性等都有差异，因此转化所需的条件亦不同，致使其转化率和再生率

33、都有所不同。张荣等(2001在以幼胚为受体的转化的试验中，研究了菌液浓度、共培养时间影响作用，认为共培养在前 3 天 GUS 表达呈上升趋势，而 3d 后呈下降趋势，这与本试验的结果相似；而浸染的菌液浓度OD600 为 0.3 左右为好，与本试验以愈伤组织为受体转化愈伤块数No. ofreceptor100125103152125113100100135125102135抗性愈伤块数No. ofresistant calli102748594124112247433126表 3 不同继代天数对玉米转化频率的影响Table 3 Effect of differentiation subcultu

34、re days on maize trans-formation品种Varieties792278599继代天数(dSubculturedays2356101223561012抗性愈伤频率(%Frequency ofresistant calli10.021.646.638.832.821.211.022.034.834.430.419.2图 2 菌浓度对玉米 7922 愈伤组织转化的影响Figure 2 Effect of bacterial conceration on transformation ofmaize 7922 calli图 3 继代天数对玉米愈伤组织转化的影响Figure

35、3 Effect of suculture days on transformation of maize calli231Page 5分子植物育种Molecular Plant Breeding的结果不同，在本试验的结果中 OD600 的值是0.50.6，但与权瑞党等(2003，在以幼胚为转化受体的试验结果相同。看来不论以幼胚还是胚性愈伤组织为受体，共培养时间以 3d 为好，而浸染时的菌液浓度后者需加 1 倍时间，说明感受细胞表现不同，幼胚相对更容易感染，细胞的感受态状况直接影响着农杆菌的转化效率。因此，合适的材料进行农杆菌转化对转化成功至关重要。Schlappi 和 Hohn(1992用农

36、杆菌法研究 3 个玉米品系幼胚不同发育阶段对农杆菌的感受性，结果表明授粉后 1416d的幼胚感染频率最高。本试验利用不同继代天数的愈伤组织作为受体，抗性愈伤率也不一致。继代初期(12d如果进行农杆菌侵染，由于愈伤组织生长状态没恢复好，生长缓慢，侵染后易变褐；而大于10d 的愈伤组织细胞侵染后也易变褐，所以一般情况下，胚性愈伤组织最好是继代 5d 左右用来侵染效果较好。但这也不是绝对的，要依不同的基因型、不同愈伤组织生理状态而定。单子叶植物难以被农杆菌转化，原因之一就是单子叶植物中存在抑制根癌农杆菌生长和对植物细胞吸附起抑制性的信号分子，它抑制根癌农杆菌 Vir基因的表达。许耀等(1993用复合

37、酚处理农杆菌，与水稻悬浮培养细胞共培养时，表明有许多细菌附着于水稻细胞表面，以利于 T-DNA 的转移，在水稻的转化试验中证实 AS 可以提高农杆菌的转化效率。因此在遗传转化过程中信号分子(乙酰丁香酮的使用，使 Vir 位点转录活化是很必要的。加入 AS，本研究抗性愈伤率可高 13.0%以上。致谢本研究由国家转基因植物中试及产业化基地(吉林专项(JY03-17-1资助。参考文献Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., and Wan Y., 1997, Genetic trans

38、formationof wheat mediated by Agrobacterium tumetaciens, PlantPhysiol., 115: 971-980Cheng Z.Q., Huang X.Q., and Wu R., 2001, Comparison of biolis-tic and Agrobacterium-immediated transformation methodson transgene copy number and rearrangement frequency inrice, Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Sinica, 43

39、(8: 826-833Gould J., Devey M., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., andSmith R.H., 1991, Transformation of Zea mays L. using A原grobacterium tuniefaciens and the shoot apex, Plant Physiol.,95: 426-434Hiei Y., Ohta S., Komari T., and Kumasho T., 1994, Efficienttransformation of rice (Oryza sativa L.

40、mediated by A原grobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA, Plant J. , 6: 271-282Huang L., and Wei Z.M., 1999, Agrobacterium tumefaciens medi-ated maize transformation, Shiyan Shengwu Xuebao(ActaBiologiae Experimentalis Sinica, 32(4: 381-387(黄璐, 卫志明, 1999, 农杆菌介导的玉米遗传转化, 实验生物学报,32

41、(4: 381-387Isshida Y., Saito H., Ohta S., Hier Y., Komari T., and KumashiroT., 1996, High efficiency transformation of maize mediatedby Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotech., 14: 745-750Liu M.Z., 1996, Agrobacterium tumefaciens mediated monocotyle-dons transformation, Yichuan(Hereditase, S1: 50-52 (刘明志,1996, 论农杆菌介导的单子叶植物转化, 遗传, 增刊: 50-52Quan R.D., Shang M., and Zhang J.R., 2003, Calli transform